$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Caratterizzazione in vitro della linea cellulare C1498
- Coltura in vitro di cellule C1498
- Preparare il terreno RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 completo aggiungendo 50 ml di siero fetale bovino (FBS), 5 ml di penicillina (100 U/ml)-streptomicina (100 μg/ml), 500 μl di 50 mM di β-mercaptoetanolo, 5 ml di acido N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano solfonato (HEPES), 5 ml di aminoacidi non essenziali e 5 ml di piruvato di sodio a 500 ml di terreno RPMI.
- Coltiva la linea cellulare C1498 in RPMI completo. Raccogliere le cellule in sospensione mediante pipettaggio e trasferirle in una provetta da 50 ml. Centrifugare a 350 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 20 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (1x), centrifugare a 350 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le cellule in 10 ml di tampone Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACs) (2,5 g di polvere di albumina sierica bovina (BSA) e 2 ml di soluzione di acido etilendiamminotetraacetico 0,5 M (EDTA) in 500 ml di soluzione di PBS). Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio delle cellule Thoma dopo aver colorato le cellule con il blu di tripano.
2. Preparazione di una sospensione cellulare su vetrini per microscopia
- Lavare 10-6 delle cellule C1498 raccolte (ottenute nella fase 1.1.4) con 5 ml di tampone FACs freddo due volte e diluire le cellule in 1 ml di tampone FACs freddo. Metti i tubi sul ghiaccio.
- Posizionare i vetrini in camere monouso con schede filtranti premontate e inserirli in una citocentrifuga.
- Aggiungere 100 μl di tampone FACs a ciascuna camera e scheda filtrante e farli girare per 2 minuti a 4,52 x g.
- Aggiungere 100 μl di cellule a ciascuna camera e scheda filtrante e centrifugare le celle a 4,52 x g per 2 minuti.
- Rimuovere con cura i vetrini dalle camere e asciugarli all'aria prima di colorarli con il colorante May-Grünwald Giemsa.
3. Colorazione di May-Grünwald Giemsa (MGG)
- Colorare le cellule (preparate nel paragrafo 2) immergendo i vetrini in un barattolo di Coplin contenente soluzione di May-Grünwald per 3 minuti.
- Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin contenente la soluzione tampone a pH 6,8 per 1 minuto.
- Colorare i vetrini mettendoli in un barattolo Coplin contenente la soluzione di Giemsa R (diluita a 1/20 in soluzione tampone a pH 6,8) per 10 minuti. Lavare i vetrini con acqua neutra (pH 7) per 10 secondi.
- Scolare e asciugare all'aria i vetrini. Montare i vetrini applicando una goccia di mezzo di montaggio 2 sulle celle. Posizionare un bordo del vetro di copertura sul vetrino e abbassarlo con cautela sulle celle utilizzando una pinza. Premere delicatamente sul vetro di copertura per rimuovere eventuali bolle d'aria.