Centrifugazione con gradiente di densità: un metodo per isolare le cellule CLL dal sangue periferico

Abstract

Fonte: Hay, J. et al. Frazionamento subcellulare delle cellule primarie di leucemia linfocitica cronica per monitorare il traffico di proteine nucleari/citoplasmatiche. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive la tecnica di isolamento delle cellule di leucemia linfatica cronica (LLC) dal sangue periferico. Con questo protocollo, isoleremo le cellule CLL da campioni di sangue di pazienti umani per la successiva generazione efficiente di frazioni nucleari e citoplasmatiche.

Protocol

1. Isolamento delle cellule di LLC dai campioni di sangue dei pazienti

1. I campioni di sangue periferico di pazienti con LLC precedentemente consenzienti vengono ricevuti dalla clinica in provette per la raccolta del sangue EDTA, accompagnati dalla conta dei globuli bianchi (WCC). Purificare i campioni di LLC nel sangue periferico secondo il WCC. Per WCC < 40 x 10⁶ cellule/mL, procedere al passaggio 1.1.1; per WCC ≥ 40 x 10⁶ cellule/mL, procedere al passaggio 1.1.2.
   1. Versare il contenuto di tutte le provette di sangue EDTA in una provetta da centrifuga conica da 50 mL e aggiungere 50 μL di cocktail di arricchimento di cellule B umane per 1 mL di sangue. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 20 min. Procedere al passaggio 1.1.2.
   2. Diluire il campione in un rapporto di 1:1 con tampone di lavaggio RT CLL (soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), siero fetale bovino allo 0,5% (FBS) e 2 mM EDTA).
2. Aliquotare i terreni a gradiente di densità RT in una provetta da centrifuga conica di dimensioni adeguate per il campione (10 mL in una provetta da 50 mL per 30 mL di campione o 4 mL in una provetta da 15 mL per 10 mL di campione).
3. Sovrapporre con cura il campione sopra il mezzo di gradiente di densità e centrifugare a 400 x g per 30 minuti a RT.
   NOTA: Assicurarsi che la centrifuga sia in posizione RT prima di inserire i campioni nella centrifuga, poiché una variazione di temperatura comporterà uno scarso arricchimento delle celle mononucleate, e spegnere il freno della centrifuga, poiché una frenata improvvisa può interrompere l'interfaccia del liquido.
4. Raccogliere delicatamente lo strato bianco di cellule mononucleate che si raccolgono all'interfaccia del terreno di gradiente di densità e del tampone di lavaggio CLL, in una nuova provetta da centrifuga conica da 50 mL utilizzando una pipetta di plastica Pasteur.
5. Aggiungere 40 mL di tampone di lavaggio CLL al monostrato isolato per lavare le cellule e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a RT.
6. Scartare il surnatante, risospendere il pellet muovendo il fondo del tubo, quindi ripetere la fase di lavaggio descritta al punto 1.5.
7. Scartare il surnatante, risospendere il pellet come descritto al punto 1.6, quindi risospendere il pellet in un volume prestabilito di tampone di lavaggio CLL (fino a 40 mL, a seconda delle dimensioni del pellet della cella).
8. Contare le cellule utilizzando il blu di tripano e un emocitometro. Quindi procedere alla citometria a flusso per verificare la purezza delle cellule LLC.
   NOTA: In questa fase, le cellule di LLC possono essere coltivate a una concentrazione di 10 x 10⁶ cellule/mL in terreni da utilizzare negli esperimenti e/o crioconservate in dimetilsolfossido al 10% (DMSO)/FBS per lavori futuri a concentrazioni fino a 100 x 10⁶ cellule/fiala.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provetta da 15 mL	Griener Bio one	188271
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Griener Bio one	616201
Dmso	sigma	D2650
Edta	sigma	Eds
Siero fetale bovino	Thermofisher	10500064
Histopaque1077 mezzi di gradiente di densità	sigma	H8889
Soluzione blu di Trypan	Thermofisher	15250061
Compresse PBS	Fisher Scientifico	BR0014G
RosetteSep Cocktail di arricchimento delle cellule B umane	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 15064
Sigma 3-16P	SciQuip		centrifuga