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1. Preparazione di frazioni subcellulari da cellule di LLC
NOTA: Quando pianifichi l'impostazione sperimentale, includi un pozzetto di cellule non stimolate/non trattate da cui può essere generato l'intero estratto cellulare.
- Eseguire la stimolazione e/o il trattamento farmacologico desiderati della linea cellulare di LLC MEC1 o delle cellule primarie di LLC isolate utilizzando 10 – 20 x 106 cellule/condizione. Le cellule verranno quindi utilizzate per il frazionamento subcellulare o per generare l'estratto di cellule intere come spiegato di seguito:
- Preparazione di soluzioni/provette: Preparare tutte le soluzioni/tamponi freschi il giorno del frazionamento prima che le cellule vengano raccolte. Conservare le soluzioni in ghiaccio fino al momento del bisogno e utilizzarle entro 4 ore dalla preparazione.
- Soluzione di PBS/inibitore della fosfatasi: Preparare gli inibitori della fosfatasi nel PBS diluendo gli inibitori della fosfatasi 1:20 in 1x PBS (ovvero, 0,5 ml di inibitori della fosfatasi in 9,5 ml di 1x PBS).
nota: Assicurarsi che gli inibitori della fosfatasi non siano precipitati. In caso di precipitazione, riscaldare a 50 °C per 10 minuti.
- Tampone ipotonico: Preparare 1x Tampone ipotonico effettuando una diluizione 1:10 di 10x tampone ipotonico in acqua distillata (ad esempio, 50 μL di 10x Tampone ipotonico in 450 μ L di dH2O).
- 10 mM di ditiotreitolo (DTT): Preparare 10 mM di DTT effettuando una diluizione 1:100 di 1M DTT con acqua distillata (cioè 10 μL di 1 M DTT in 990 μL di dH2O).
nota: Il DTT è altamente labile, quindi preparalo fresco ogni volta. Evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento.
- Tampone di lisi completo: determina la quantità di tampone necessaria per ogni esperimento. Ogni campione richiede 50 μL di tampone di lisi completo, quindi aggiungere 5 μL di DTT da 10 mM a 44,5 μL di tampone di lisi e quindi aggiungere 0,5 μL di cocktail di inibitori della proteasi. Questa quantità può essere aumentata a seconda del numero di campioni nell'esperimento.
- Etichettare quattro set di provette per microfughe da 1,5 mL per ogni stimolazione e/o trattamento farmacologico per le cellule appena stimolate, le frazioni citoplasmatiche appena generate, le frazioni nucleari appena generate e i lisati cellulari interi. Pre-raffreddare questi tubi di microfuge sul ghiaccio fino al momento del bisogno.
- Trasferire le cellule in provette per microfuge da 1,5 mL etichettate singolarmente e in pellet centrifugando a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di inibitori della PBS/fosfatasi ghiacciati. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e mantenere i pellet di celle in ghiaccio.
- Preparazione delle frazioni citoplasmatiche: Risospendere delicatamente i pellet cellulari da utilizzare per il frazionamento subcellulare in 50 μL di 1x tampone ipotonico. Incubare le cellule su ghiaccio per 15 minuti per consentire alle cellule di gonfiarsi.
nota: Il volume del tampone ipotonico utilizzato può essere aumentato empiricamente a seconda del numero di cellule.
- Aggiungere 0,8 - 2,5 μl (da 1:20 a 1:60) di detergente in ciascun campione e agitare l'impostazione massima per 10 s.
- Per determinare la concentrazione ottimale di detergente da utilizzare per un tipo specifico di cellula per isolare frazioni nucleari e citoplasmatiche, eseguire inizialmente un gradiente di detergente. Un intervallo compreso tra 1:20 e 1:60 (cioè da 2,5 μL a 0,8 μL di detergente in 50 μL di tampone ipotonico) dovrebbe essere adeguato.
nota: Se il volume del tampone ipotonico al punto 3.4 viene regolato, assicurarsi che venga mantenuto il rapporto detergente appropriato.
- Verificare la lisi cellulare osservando le cellule utilizzando un microscopio a contrasto di fase prima e dopo l'aggiunta di detergente. Le cellule intere appaiono più grandi con un nucleo denso e scuro. Il citoplasma apparirà come un alone luminoso attorno al nucleo.
nota: L'appropriata lisi è ulteriormente confermata utilizzando il Western blotting per analizzare proteine specifiche all'interno delle frazioni lisate generate dal gradiente detergente.
- Una volta lisati, centrifugare i campioni a 14.000 x g per 30 s a 4 °C.
- Trasferire con cura il surnatante in una provetta per microfusibile pre-raffreddata ed etichettata. Questa frazione citoplasmatica può essere conservata a -80 °C fino a quando non è necessaria per ulteriori analisi. Il pellet rimanente contiene la frazione nucleare.
nota: Evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento dei campioni.
- Preparazione delle frazioni nucleari: Risospendere ogni pellet nucleare in 50 μL di tampone di lisi completo mediante pipettaggio su e giù.
NOTA: Il volume del tampone di lisi completo può essere regolato empiricamente in base al numero di cellule di partenza.
- Aggiungere 2,5 μL di detergente per solubilizzare le proteine associate alla membrana nucleare e vorticare all'impostazione massima per 10 s. Incubare i campioni su ghiaccio per 30 minuti.
- Agitare l'impostazione massima per 30 s, quindi centrifugare i campioni a 14.000 x g per 20 minuti a 4 °C.
- Trasferire il surnatante in una provetta per microfuge pre-raffreddata ed etichettata. Questa frazione nucleare può essere conservata a -80 °C fino a quando non è necessaria per ulteriori analisi.
nota: Evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento dei campioni.