Saggio del flusso extracellulare: un metodo per misurare il profilo metabolico delle cellule

Abstract

Fonte: Hlozkova K. et al. Valutazione del profilo metabolico delle cellule leucemiche primarie. J. Vis. Exp. (2018).

Questo protocollo fornisce un approccio biochimico per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) delle cellule leucemiche primarie con saggio del flusso extracellulare. La valutazione del profilo metabolico di queste cellule aiuta a caratterizzare le loro richieste, portando a una terapia personalizzata.

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti

1. Preparare 500 mL di PBS sciogliendo 137 mM di NaCl, 2,7 mM di KCl, 4,3 mM di Na₂HPO₄, 1,47 mM di KH₂PO₄, in ddH₂O. Regolare il pH a 7,4 con HCl. Sterilizzare in autoclave.
2. Preparare 100 mL di terreno RPMI: terreno RPMI-1640 con L-Alanil-Glutammina integrata con il 10% di siero fetale bovino (FBS), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 μg/mL).
3. Preparare 50 ml di 0,1 M NaHCO₃ in acqua distillata. Regolare il pH a 8,1, filtrare sterilizzare (0,22 μm) e conservare a 4 °C.
   nota: Per due piastre analizzatrici di flusso ....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Analizzatore di cavallucci marini XFp	Tecnologie Agilent	S7802A
Minipiastra per colture cellulari Seahorse XFp	Tecnologie Agilent	Codice 103025-100
Corning™ Cell-Tak Adesivo per cellule e tessuti	ThermoFisher Scientifico	CB40240
D-(+) Glucosio	Sigma-Aldrich	G7021-100G
Oligomicina A	Sigma-Aldrich	75351-5MG
2-Deossi-D-glucosio	Sigma-Aldrich	D8375-1G
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920-10MG
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875-1G
Antimicina A da Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674-25MG
Cavalluccio marino XF base medio, 100mL	Tecnologie Agilent	Codice 103193-100
Soluzione di L-glutammina, 200 mM	Sigma-Aldrich	G7513-100ML