1. Preparazione dei reagenti
- Preparare 500 mL di PBS sciogliendo 137 mM di NaCl, 2,7 mM di KCl, 4,3 mM di Na2HPO4, 1,47 mM di KH2PO4, in ddH2O. Regolare il pH a 7,4 con HCl. Sterilizzare in autoclave.
- Preparare 100 mL di terreno RPMI: terreno RPMI-1640 con L-Alanil-Glutammina integrata con il 10% di siero fetale bovino (FBS), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 μg/mL).
- Preparare 50 ml di 0,1 M NaHCO3 in acqua distillata. Regolare il pH a 8,1, filtrare sterilizzare (0,22 μm) e conservare a 4 °C.
nota: Per due piastre analizzatrici di flusso extracellulare a 8 pozzetti, preparare 250 μl di 0,1 M NaHCO3 pH 8,1.
- Preparare 1 mL di D-glucosio 2 M in acqua distillata. Sterilizzare con filtro (0,22 μm) e conservare a -20 °C.
- Preparare 100 μl di 1 mM di oligomicina A in etanolo. Sterilizzare con filtro (0,22 μm) e conservare a -20 °C.
- Preparare 250 μL di 1 M 2-deossi-D-glucosio (2-DG) in DMEM minimo (terreno di Dulbecco's Modified Eagle). Riscaldare a 37 °C e regolare il pH a 7,4 (eseguire la misurazione del pH a 37 °C). Sterilizzare con filtro (0,22 μm) e conservare a -20 °C.
- Preparare 100 μl di 1 mM di FCCP (cianuro di carbonile-p-trifluorometossifenilidrazone) in DMSO. Sterilizzare con filtro (0,22 μm) e conservare a -20 °C.
- Preparare 100 μL di 1 mM di Rotenone in etanolo. Sterilizzare con filtro (0,22 μm) e conservare a -20 °C.
- Preparare 100 μL di 1 mg/mL di antimicina A in etanolo. Sterilizzare con filtro (0,22 μm) e conservare a -20 °C.
- Poco prima dell'uso, preparare 10 mL di terreno per stress test di glicolisi. Scaldare il DMEM minimo a 37 °C a bagnomaria e regolare il pH a 7,4 (eseguire la misurazione del pH a 37 °C).
- Prima dell'uso, preparare 10 mL di terreno per stress test Cell Mito con BSA. Integrare Minimal DMEM con 2 mM di L-glutammina, 10 mM di D-glucosio, 1 mM di HEPES (pH 7,4), 1 mM di piruvato e 0,1% di BSA (albumina sierica bovina). Scaldare a 37 °C a bagnomaria e regolare il pH a 7,4 (eseguire la misura di pH a 37 °C).
- Prima dell'uso, preparare 10 mL di terreno per stress test Cell Mito senza BSA. Integrare Minimal DMEM con 2 mM di L-glutammina, 10 mM di D-glucosio, 1 mM di HEPES (pH 7,4) e 1 mM di piruvato. Mezzo per stress test Warm Cell Mito senza BSA a 37 °C in bagnomaria e regolazione del pH a 7,4 (eseguire la misurazione del pH a 37 °C).
NOTA: La BSA viene aggiunta al terreno per lo stress test Cell Mito perché le cellule rispondono meglio alla FCCP quando il terreno viene integrato con BSA (sono state testate diverse condizioni). Per il caricamento delle porte viene utilizzato il mezzo di stress Cell Mito senza BSA, poiché il produttore sconsiglia l'uso di BSA nel mezzo.
2. Coltivazione notturna di cellule mononucleate
NOTA: Eseguire tutti i passaggi secondari in una cappa sterile per coltura tissutale.
- Preparare due matracci T75 con 20 ml di RPMI. Ad ogni pallone, aggiungere 30 x 106 celle mononucleate isolate. Incubare le cellule con il matraccio in piedi per 16-24 ore al 5% di CO2 e 37 °C.
3. Preparazione delle piastre rivestite di adesivo per celle
- Rivestire due piastre analizzatrici di flusso extracellulare a 8 pozzetti.
nota: Eseguire il rivestimento in una cappa di coltura tissutale sterile.
- Aggiungere 2,2 μL di adesivo cellulare (densità: 2,54 mg/ml) a 250 μL di 0,1 M NaHCO3, pH 8,1 e pipettare immediatamente 12,5 μL della soluzione in ciascun pozzetto.
nota: Le soluzioni stock di adesivi cellulari possono differire nella loro densità, regolare di conseguenza il volume aggiunto a NaHCO3.
- Lasciare riposare le piastre nella cappa per circa 20 minuti, quindi aspirare l'adesivo cellulare e lavare ogni pozzetto due volte utilizzando 200 μL di acqua sterile. Lascialo riposare nella cappa con il coperchio aperto fino a quando i pozzetti non saranno asciutti.
- Utilizzare subito le piastre o conservare fino a 1 settimana a 4 °C con il bordo avvolto in un film di paraffina per evitare la condensa. Assicurarsi che le piastre siano riscaldate a temperatura ambiente (per circa 20 minuti) nella cappa prima di seminare le cellule.
4. Idratazione della cartuccia del sensore
NOTA: Idrata due cartucce per analizzatori di flusso extracellulare a 8 pozzetti.
- Separare la piastra di servizio e la cartuccia del sensore. Posizionare la cartuccia del sensore capovolta sul banco da laboratorio.
- Riempire ogni pozzetto della piastra di servizio con 200 μl di calibrante. Riempire ogni fossato intorno all'esterno dei pozzetti con 400 μL di calibrante.
- Riposizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di servizio che ora contiene il calibratore.
- Collocare il gruppo cartuccia in un'incubatrice umidificata, senza CO2, 37 °C per una notte.
- Accendere l'analizzatore di flusso extracellulare e lasciarlo riscaldare a 37 °C per una notte.
5. Semina di cellule in piastre rivestite di adesivo cellulare
NOTA: Per il test da sforzo della glicolisi, utilizzare il mezzo per lo stress test della glicolisi. Per lo stress test Cell Mito, utilizzare il terreno per stress test Cell Mito con BSA.
- Cellule seme per lo stress test Glycolysis e lo stress test Cell Mito in piastre separate. Per ogni test, utilizzare le cellule di un pallone con coltura notturna.
- Centrifugare le celle a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 1 mL del terreno appropriato e contarle.
- Aggiungere 4 x 106 di cellule vive al volume finale di 400 μl (utilizzare un terreno appropriato).
- Piastra 50 μl della sospensione cellulare in pozzetti B-G. Assicurarsi che 500.000 cellule vengano seminate in un pozzetto.
nota: È fondamentale seminare esattamente 500.000 cellule per pozzetto, poiché non viene eseguita nessun'altra normalizzazione. In questo modo, i risultati di diversi pazienti possono essere confrontati. Il numero ottimale di repliche è sei, come descritto qui. L'uso di meno repliche non è raccomandato poiché le cellule primarie a volte potrebbero comportarsi in modo errato.
- Aggiungere 180 μl del terreno appropriato nei pozzetti A e H (questi pozzetti serviranno come correzione dello sfondo).
- Centrifugare la piastra a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente con il freno impostato su 1.
- Aggiungere lentamente e con attenzione 130 μl di terreno appropriato ai pozzetti B-G in due piastre analizzatrici di flusso extracellulare a 8 pozzetti. Confermare visivamente che le cellule aderiscano stabilmente al fondo dei pozzetti osservandole al microscopio.
- Immergere la piastra in un'incubatrice umidificata, senza CO2, a 37 °C per 30 minuti.
6. Caricamento della cartuccia del sensore
- Per il test da sforzo della glicolisi, preparare 250 μl ciascuno di 100 mM di glucosio, 20 μM di oligomicina A e 1 M 2-DG, tutti in terreno di prova da sforzo della glicolisi.
- Per lo stress test Cell Mito, preparare 250 μL ciascuno di 20 μM di oligomicina A, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP e una miscela di 10 μM di rotenone e 10 μg/ml di antimicina A, il tutto in un terreno di stress test Cell Mito senza BSA.
nota: Si raccomanda di iniettare due concentrazioni di FCCP in un unico test poiché non c'è abbastanza materiale per i pazienti per la titolazione FCCP. Tuttavia, le concentrazioni dovrebbero essere determinate dal ricercatore.
- Caricare i composti nelle apposite porte dell'iniettore della cartuccia come segue (Tabella 1):
7. Impostazione del programma
- Per lo stress test della glicolisi, impostare il programma come descritto nella Tabella 2.
- Per lo stress test Cell Mito, impostare il programma come descritto nella Tabella 3.
- Avvia il programma. Sostituire la piastra di calibrazione con la piastra di analisi (quando richiesto).
| porto | Test di stress della glicolisi | Test di stress mito cellulare |
| Caricare nella porta | Concentrazione finale nei pozzi | Caricare nella porta | Concentrazione finale nei pozzi |
| un | 20 μL di glucosio 100 mM | 10 mM di glucosio | 20 μL di oligomicina A da 20 μM | 2 μM di oligomicina A |
| E | 22 μL di oligomicina A da 20 μM | 2 μM di oligomicina A | 22 μL di 15 μM FCCP | FCCP da 1,5 μM |
| E | 25 μl di 1 M 2-DG | 100 mM 2-DG | 25 μL di FCCP da 30 μM | FCCP da 4,5 μM |
| D | X | | 25 μL di 10 μM di Rotenone e 10 μg/ml di Antimicina A | 1 μM di rotenone e 1 μg/ml di antimicina A |
Tabella 1: Volumi composti.
| passo | Impostazioni |
| taratura | Automatico |
| equilibrio | Automatico |
| Misurazione di base | Tre volte: Mescolare – 3 min, Attendere – 0 min, Misurare – 3 min |
| Iniezione della porta A | iniezione |
| misurazione | Tre volte: Mescolare – 3 min, Attendere – 0 min, Misurare – 3 min |
| Iniezione della porta B | iniezione |
| misurazione | Tre volte: Mescolare – 3 min, Attendere – 0 min, Misurare – 3 min |
| Iniezione della porta C | iniezione |
| misurazione | Quattro volte: Mescolare – 3 min, Attendere – 0 min, Misurare – 3 min |
Tabella 2: Programma per lo stress test della glicolisi.
| passo | Impostazioni |
| taratura | Automatico |
| equilibrio | Automatico |
| Misurazione di base | Tre volte: Mescolare – 3 min, Attendere – 0 min, Misurare – 3 min |
| Iniezione della porta A | iniezione |
| misurazione | Tre volte: Mescolare – 3 min, Attendere – 0 min, Misurare – 3 min |
| Iniezione della porta B | iniezione |
| misurazione | Tre volte: Mescolare – 3 min, Attendere – 0 min, Misurare – 3 min |
| Iniezione della porta C | iniezione |
| misurazione | Tre volte: Mescolare – 3 min, Attendere – 0 min, Misurare – 3 min |
| Iniezione della porta D | iniezione |
| misurazione | Tre volte: Mescolare – 3 min, Attendere – 0 min, Misurare – 3 min |
Tabella 3: Programma per lo stress test Cell Mito.
