Raccolta del midollo osseo dall'arto posteriore del topo

Abstract

Fonte: Zhu, Y. P., Padgett, et al. Preparazione dell'intero midollo osseo per l'analisi della citometria di massa delle cellule del lignaggio dei neutrofili. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive un protocollo dettagliato per isolare il midollo osseo intero fresco dagli arti posteriori del topo per studiare i difetti dell'intero midollo osseo per i pazienti con malattie del sangue come la leucemia.

Protocollo

1. Raccogli midollo osseo di topo (BM)

1. Acquista i mouse C57BL/6J da un rivenditore commerciale. Nutri la dieta standard per roditori e alloggia in gabbie per microisolatori in una struttura priva di agenti patogeni.
2. Utilizzare topi maschi, di 6-10 settimane di età, a scopo sperimentale. Eutanasia per inalazione di CO₂ seguita dalla lussazione cervicale.
3. Posizionare il mouse su un tampone chirurgico sterile con l'addome rivolto verso l'alto. Sterilizzare la pelle dell'addome e della zona degli arti posteriori spruzzando etanolo al 70%. Usa un paio di forbici chirurgiche da dissezione per aprire la cavità addominale.
4. Rimuovere la pelle per esporre gli arti posteriori. Usa un paio di pinze da medicazione a punta smussata per tenere la tibia del topo proprio sotto la caviglia. Utilizzare un altro paio di pinze per medicazione curve per stabilizzare la tibia sotto le pinze per medicazione a punta smussata. Rompere la tibia ed esporre l'osso strappando il muscolo con la pinza per medicazione a punta smussata.
   nota: La tibia è attaccata liberamente all'articolazione del ginocchio e può essere facilmente individuata utilizzando la pinza per medicazione a punta smussata.
5. Metti la tibia in 1x PBS freddo.
6. Quindi, sposta la pinza per medicazione curva stabilizzatrice verso il basso verso il femore. Far scorrere la pinza per medicazione a punta smussata sotto l'articolazione del ginocchio e tenere la rotula. Dislocare la rotula tirandola delicatamente verso l'alto. Esporre il femore strappando il muscolo attaccato alla rotula. Tenere il femore esposto per la pinza per medicazione curva e tagliare il femore dal fondo dell'osso usando le forbici chirurgiche da dissezione.
7. Metti il femore in 1x PBS freddo.
8. Praticare un foro in una provetta da microcentrifuga da 0,5 ml con un ago da 18 G.
9. Posizionare sia la tibia che il femore nella stessa provetta da microcentrifuga da 0,5 ml con l'estremità aperta delle ossa rivolta verso il basso rispetto al foro.
10. Inserire la provetta da 0,5 mL contenente sia la tibia che il femore in una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL.
11. Centrifugare le provette a doppio strato contenenti sia la tibia che il femore a 5.510 x g per 30 s nella microcentrifuga.
12. Assicurarsi che il midollo osseo sia estratto dalle ossa e pellettato sul fondo del tubo. Gettare la provetta da 0,5 ml contenente le ossa sacre. Il BM del mouse è pronto per i passaggi successivi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mouse: C57BL/6J	Il laboratorio Jackson	Codice prodotto: 000664
HyClone Fosfato Soluzione salina tamponata	GE Scienze della vita	Gatto#SH30256.01