Arricchimento delle cellule T: una tecnica per isolare le cellule T da una popolazione di cellule miste mediante separazione magnetica

Abstract

Fonte: Nguyen, H. D., et al. Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia del trapianto contro l'ospite. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video descrive l'arricchimento delle cellule T dalla milza di un topo mediante selezione negativa utilizzando un separatore magnetico. La tecnica prevede di indirizzare le altre cellule del campione per la deplezione utilizzando anticorpi o ligandi diretti contro specifici antigeni della superficie cellulare.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Giorno 1: Prepara le cellule T dai topi donatori

1. Utilizzare topi CD45.2⁺ H2k^b+ C57BL/6 wild type (WT) come donatori per le cellule T.
2. Eutanasia i topi C57BL/6 per asfissia da anidride carbonica (CO₂) e attendere 2-3 minuti fino a quando non perdono conoscenza. Se necessario, eseguire la lussazione cervicale come eutanasia secondaria.
3. Pulisci accuratamente il pelo e la pelle del topo con etanolo al 70%. Asportare la milza e i linfonodi e separarli in una singola sospensione cellulare di splenociti utilizzando uno stantuffo a siringa e filtri a rete da 40 μm. Lavare il colino e lo stantuffo della siringa con RPMI all'1% (FBS all'1% contenente terreni RPMI) per raccogliere tutti gli splenociti.
4. Centrifugare la sospensione cellulare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Aggiungere 5 mL di tampone di lisi ACK (1 mM Na₂EDTA, 10 mM KHCO₃, 144 mM NH₄Cl, pH 7,2) dopo aver eliminato il surnatante. Incubare la sospensione cellulare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   nota: Il tampone di lisi ACK viene utilizzato per la lisi dei globuli rossi.
5. Aggiungere 5 mL di RPMI all'1% per interrompere la lisi. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
6. Preparare un tampone MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting) ghiacciato (0,5% BSA, 2 mM EDTA in PBS, pH 7,2). Degassare il tampone prima dell'uso. Risospendere i pellet cellulari in 5 mL di tampone MACS.
7. Contare gli splenociti e verificare la presenza di cellule vive e morte utilizzando un emocitometro e blu di tripano all'1%. Conservare un'aliquota di 2 x 10⁶ celle per valutare la resa di purificazione con l'analisi di citometria a flusso.
8. Risospendere gli splenociti alla concentrazione di 200 x 10⁶/mL in tampone MACS. Aggiungere 0,03 μL di biotina anti-topo-Ter-119, 0,03 μL di biotina anti-topo-CD11b, 0,03 μL di biotina anti-topo-CD45R e 0,03 μL di biotina anti-topo-DX5 per 10⁶ cellule. Incubare per 15 minuti a 4 °C.
   nota: La biotina anti-topo-Ter-119, la biotina anti-topo-CD11b, la biotina anti-topo-CD45R e la biotina anti-topo-DX5 sono stati utilizzati per reagire rispettivamente con eritroidi, granulociti, cellule B e cellule NK. Pertanto, questi sottoinsiemi di cellule si esauriscono nel passaggio successivo.
9. Aggiungere 10 mL di tampone MACS ghiacciato alla sospensione cellulare. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
10. Risospendere i pellet cellulari nel tampone MACS a una concentrazione di 100 x 10⁶/mL. Aggiungere microsfere anti-biotina (0,22 μL/10⁶ cellule) alla sospensione di splenociti. Mescolare bene e incubare per altri 15 minuti a 4 °C. Lavare una volta la sospensione cellulare con 10 mL di tampone MACS ghiacciato. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
11. Inserire una colonna di separazione magnetica nel campo magnetico. Sciacquare la colonna con 3 mL di tampone MACS. Far cadere la sospensione cellulare sulla colonna. Raccogliere il flusso continuo costituito da cellule T arricchite e non legate in una nuova provetta conica da 15 mL. Lavare la colonna MS con 3 mL di tampone MACS ghiacciato.
    nota: Assicurarsi che la colonna sia vuota prima di eseguire le fasi di lavaggio.
12. Centrifugare la sospensione cellulare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone MACS.
13. Contare le cellule in blu di tripano all'1% utilizzando un emocitometro. Conservare un'aliquota di 2 x 10⁶ cellule per un controllo della purezza mediante citometria a flusso.
    nota: La resa media delle cellule T spleniche isolate con questo metodo è di ~20-25 x 10⁶ cellule per topo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
RPMI 1640	Thermo Fisher Scienctific	Codice 11875-093	media
MidiMACS	Miltenyi Biotec	Codice 130-042-302	Arricchimento delle cellule T
0,5 M EDTA pH 8,0 100ML	Fisher Scientifico	BP2482100	Buffer MACS
10X PBS	Fisher Scientifico	BP3994	Buffer MACS
Microsfere anti-biotina	Miltenyi Biotec	Codice 130-090-485	Arricchimento delle cellule T
Anti-umano/topo CD45R (B220)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 13-0452-85	Arricchimento delle cellule T
Anti-Topo CD4 Biotina	Thermo Fisher Scientifico	13-0041-86	Arricchimento delle cellule T
CD11b	Thermo Fisher Scientifico	Codice 13-0112-85	Arricchimento delle cellule T
CD25-biotina	Thermo Fisher Scientifico	13-0251-82	Arricchimento delle cellule T
CD45R	Thermo Fisher Scientifico	13-0452-82	Arricchimento delle cellule T
Anticorpo monoclonale CD49b (DX5)-biotina	Thermo Fisher Scientifico	13-5971-82	Arricchimento delle cellule T
Anti-Topo TER-119 Biotina	Thermo Fisher Scientifico	Codice 13-5921-85	Arricchimento delle cellule T
Anti-topo CD45.1 PE	Thermo Fisher Scientifico	12-0900-83	Analisi di citometria a flusso
C57BL/6 mouse	Fiume Carlo	27	Donatori/Riceventi
Provette per citometria a flusso	Fisher Scientifico	352008	Analisi di citometria a flusso
Filtro cellulare 40 uM	Thermo Fisher Scientifico	22363547	Preparazione delle cellule