Generazione di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo: un metodo per generare cellule dendritiche dal midollo osseo di topo

1. Genera cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BM-DC).

1. Isolare il midollo osseo dai femori e dalle tibie di topi WT o fattore B (fB)^-/- sullo sfondo B6. In breve, raccogli la tibia e il femore da entrambe le gambe usando pinze e forbici. Mettili in RPMI ghiacciato contenente l'1% di FCS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina e 2 mM di L-glutammina (1% RPMI) in provette coniche da 50 mL. Pulire accuratamente il femore e le ossa della tibia rimuovendo tutti i tessuti muscolari con pinze e forbici. Trasferire il femore e la tibia dalle provette coniche da 50 mL a una piastra di Petri da 92 mm di diametro contenente l'1% di RPMI. Usando le forbici, taglia le estremità del femore o della tibia. Riempire una provetta da 50 mL con 25 mL di terreno RPMI 1640 all'1%. Utilizzare questo per riempire una siringa da 3 ml collegata a un ago da 26 G con 3 ml di RPMI all'1%. Inserire questa siringa nell'osso e spingere lo stantuffo per espellere il midollo osseo (BM) dalla cavità nella provetta di raccolta con RPMI all'1% (~3 mL/osso). Centrifugare le celle a 800 x g per 5 min.
2. Risospendere il pellet in 5 mL di tampone di lisi ACK per la lisi dei globuli rossi. Incubare la sospensione cellulare per 5 minuti con ghiaccio. Aggiungere 10 mL di RPMI all'1% alla sospensione cellulare per arrestare la lisi e centrifugare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
3. Risospendere i pellet cellulari in 10 mL di terreno di coltura (RPMI 1640 contenente il 10% di FBS, 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2 mM di l-glutammina e 50 mM di β-mercaptoetanolo) e regolare il volume per raggiungere la concentrazione finale di 2 x 10⁶ cellule/mL.
4. Aggiungere 20 ng/mL di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) alla sospensione cellulare. Coltura delle cellule del midollo osseo in piastre di Petri da 100 x 15 mm a 37 °C in CO₂ al 5% per 6 giorni.
5. Sostituire metà del terreno di coltura in corso (circa 5 mL) con terreno fresco contenente 40 ng/mL GM-CSF il giorno 3.
6. Preriscaldare il terreno di coltura in un bagno d'acqua a 37 °C. Raccogliere circa 5 mL di terreno dalle piastre di coltura del midollo osseo. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in un terreno di coltura da 5 mL contenente 40 ng/mL di gm-CSF.
7. Aggiungere 25 μg/mL di lipopolisaccaride (LPS) al terreno il giorno 6 della coltura per far maturare i BM-DC. Conservare un'aliquota di 2 x 10⁶ cellule per determinare l'efficacia della differenziazione delle DC mediante citometria a flusso.
8. Raccogli BM-DC maturi: usa i sollevatori di cellule per raschiare delicatamente le DC dalle piastre di Petri. Raccogliere tutte le sospensioni cellulari in provette coniche da 50 mL. Centrifugare a 800 x g, per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante. Lavare i pellet delle celle 3 volte con 50 ml di PBS ghiacciato. Conservare circa 2 x 10⁶ BM-DC per l'analisi del fenotipo immunologico mediante citometria a flusso.