Generazione di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo: un metodo per generare cellule dendritiche dal midollo osseo di topo

Abstract

Source:Nguyen, H. D., et al. Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia del trapianto contro l'ospite. (2020).

Questo video descrive un protocollo per la generazione di cellule dendritiche - cellule chiave che presentano l'antigene che attivano le cellule T - dal midollo osseo di un topo adulto.

Protocollo

1. Genera cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BM-DC).

1. Isolare il midollo osseo dai femori e dalle tibie di topi WT o fattore B (fB)^-/- sullo sfondo B6. In breve, raccogli la tibia e il femore da entrambe le gambe usando pinze e forbici. Mettili in RPMI ghiacciato contenente l'1% di FCS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina e 2 mM di L-glutammina (1% RPMI) in provette coniche da 50 mL. Pulire accuratamente il femore e le ossa della tibia rimuovendo tutti i tessuti muscolari con pinze e forbici. Trasferire il femore e la tibia dalle provette coniche da 50 mL a una piastra di Petri da 92 mm di diametro contenente l'1% di RPMI. Usando le forbici, taglia le estremità del femore o della tibia. Riempire una provetta da 50 mL con 25 mL di terreno RPMI 1640 all'1%. Utilizzare questo per riempire una siringa da 3 ml collegata a un ago da 26 G con 3 ml di RPMI all'1%. Inserire questa siringa nell'osso e spingere lo stantuffo per espellere il midollo osseo (BM) dalla cavità nella provetta di raccolta con RPMI all'1% (~3 mL/osso). Centrifugare le celle a 800 x g per 5 min.
2. Risospendere il pellet in 5 mL di tampone di lisi ACK per la lisi dei globuli rossi. Incubare la sospensione cellulare per 5 minuti con ghiaccio. Aggiungere 10 mL di RPMI all'1% alla sospensione cellulare per arrestare la lisi e centrifugare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
3. Risospendere i pellet cellulari in 10 mL di terreno di coltura (RPMI 1640 contenente il 10% di FBS, 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2 mM di l-glutammina e 50 mM di β-mercaptoetanolo) e regolare il volume per raggiungere la concentrazione finale di 2 x 10⁶ cellule/mL.
4. Aggiungere 20 ng/mL di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) alla sospensione cellulare. Coltura delle cellule del midollo osseo in piastre di Petri da 100 x 15 mm a 37 °C in CO₂ al 5% per 6 giorni.
5. Sostituire metà del terreno di coltura in corso (circa 5 mL) con terreno fresco contenente 40 ng/mL GM-CSF il giorno 3.
6. Preriscaldare il terreno di coltura in un bagno d'acqua a 37 °C. Raccogliere circa 5 mL di terreno dalle piastre di coltura del midollo osseo. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in un terreno di coltura da 5 mL contenente 40 ng/mL di gm-CSF.
7. Aggiungere 25 μg/mL di lipopolisaccaride (LPS) al terreno il giorno 6 della coltura per far maturare i BM-DC. Conservare un'aliquota di 2 x 10⁶ cellule per determinare l'efficacia della differenziazione delle DC mediante citometria a flusso.
8. Raccogli BM-DC maturi: usa i sollevatori di cellule per raschiare delicatamente le DC dalle piastre di Petri. Raccogliere tutte le sospensioni cellulari in provette coniche da 50 mL. Centrifugare a 800 x g, per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante. Lavare i pellet delle celle 3 volte con 50 ml di PBS ghiacciato. Conservare circa 2 x 10⁶ BM-DC per l'analisi del fenotipo immunologico mediante citometria a flusso.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10X PBS	Fisher Scientifico	BP3994	Buffer MACS
B6 fB-/- mouse	Università della Florida centrale	In casa	Destinatari
B6. Topi Ly5.1 (CD45.1 +)	Fiume Carlo	546	Donatori
Topi BALB/c	Fiume Carlo	28	Riceventi di trapianto
C57BL/6 mouse	Fiume Carlo	27	Donatori/Riceventi
Siero fetale bovino (FBS)	Sistema di ricerca e sviluppo di Atlanta Bilogicals	D17051	Coltura cellulare
Lipopolisaccaride (LPS)	Millipore Sigma	L4391-1MG	DC maturo
Incubatrice New Brunswick Galaxy 170R	Eppendorf	Galassia 170 R	Coltura cellulare
Penicilina+streptomicinaPenicillina/ Streptomicina (10.000 unità di penicillina / 10.000 mg/ml di streptococco)	GIBCO	Codice: 15140	media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scienctific	Codice 11875-093	media