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1. Fissazione, lisi cellulare e taglio della cromatina
NOTA: I campioni dei pazienti e le cellule Jurkat vengono fissati e lisati con un kit ChIP disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore con le modifiche descritte in precedenza. La fissazione viene eseguita sotto una cappa a flusso laminare.
- Preparare una provetta da 1,5 mL con 1 mL di formaldeide al 37%, una provetta da 1,5 mL con 1 mL di glicina 1,25 M, una provetta da 5 mL con 4 mL di 1x PBS e una scatola con ghiaccio per il fissaggio delle cellule.
- Dopo la stimolazione delle cellule per il rispettivo tempo di incubazione, stimolare le cellule aggiungendo 32,4 nM di forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e 1 μM di ionomicina. Quindi incubare le cellule per 16 ore a 37 °C e 5% di CO2 con il coperchio della provetta aperto (per evitare contaminazioni, è possibile utilizzare una pellicola sigillante permeabile all'aria), centrifugare le provette da 5 mL a 200 x g per 5 minuti e risospendere le cellule in 500 μL di PBS nelle provette da 5 mL.
- Aggiungere 340 μM di formaldeide (13,5 μL di formaldeide al 37%) alle cellule. Dopo una breve miscelazione mediante pipettaggio accurato su e giù, incubare la sospensione per 2,5 minuti (cellule Jurkat) o 5 minuti (campione del paziente) a temperatura ambiente.
nota: È necessario un tempo di fissazione prolungato per le cellule primarie per garantire una tosatura ottimale.
- Aggiungere 125 mM di glicina (57 μl di 1,25 M di glicina) per interrompere la fissazione e incubare per altri 5 minuti. Mettere le cellule in ghiaccio subito dopo e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante per aspirazione.
- Lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS ghiacciato a 200 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante ogni volta mediante aspirazione.
nota: Dopo la fissazione, il protocollo può essere messo in pausa. Le celle fisse devono essere conservate a -80 °C. Per testare, se l'epitopo dell'anticorpo che si intende utilizzare nel protocollo seguente non è mascherato tramite fissazione, è possibile utilizzare campioni aggiuntivi per l'analisi tramite elettroforesi su gel SDS-PAGE e Western blot. Questi passaggi vengono eseguiti con 100 μg di proteine secondo le istruzioni del produttore. Tutti gli anticorpi αNFAT2 sono utilizzati con una diluizione di 1:1000, l'anticorpo GAPDH con una diluizione di 1:10000. Un'immagine esemplare di campioni fissati da cellule Jurkat con anticorpi appropriati e inappropriati è mostrata nella Figura 1.
- Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone di lisi 1 disponibile in commercio mediante pipettaggio su e giù. Quindi, posizionare i campioni sul ghiaccio su uno shaker e incubarli per 10 minuti agitandoli.
nota: Prima della lisi, le cellule possono essere disintegrate per 10 s in azoto liquido. Questo è utile per le cellule Jurkat, ma dovrebbe essere evitato nei campioni primari dei pazienti. Per la disintegrazione, posizionare le provette da 5 mL per 5 s in 5-10 mL di azoto liquido in un contenitore specifico. Indossare occhiali di sicurezza e guanti di sicurezza adeguati.
- Successivamente, centrifugare le provette a 500 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere con cura il surnatante mediante pipettaggio.
- Omogeneizzare le cellule in 5 mL di tampone di lisi 2 disponibile in commercio mediante pipettaggio su e giù e incubare per 10 minuti su ghiaccio agitando. Quindi centrifugare le provette a 500 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere con cura il surnatante mediante pipettaggio.
- Risospendere il pellet cellulare in 500 μL (cellule Jurkat) o 140 μL (campioni di pazienti) del tampone di taglio 1 contenente 1x inibitore della proteasi (5 μL o 1,4 μL, rispettivamente) e incubare la miscela per 10 minuti su ghiaccio.
- Per il taglio della cromatina, trasferire 140 μl della sospensione cellulare dalla fase 1.9 nei tubi del sonicatore (evitare di produrre bolle d'aria e ripetere questo passaggio se necessario a causa del volume del campione). Posizionare le provette nell'ultra-suonatore focalizzato a una temperatura di 7 °C e tagliarle per 10 minuti (linea cellulare) o 7,5 minuti (campioni di pazienti) con una potenza incidente media di 9,375 W per ottenere frammenti di DNA di 200-500 bp.
- Infine, centrifugare a 15700 x g per 10 minuti a 4 °C nella centrifuga piccola e raccogliere il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL.
- Per verificare le dimensioni appropriate dei frammenti, analizzare 20 μl della cromatina tranciata tramite elettroforesi su gel in gel di agarosio all'1,5% di TBE. Un'immagine esemplare della cromatina tranciata da cellule Jurkat di buona e cattiva qualità è mostrata nella Figura 2. A questo punto, il protocollo può essere potenzialmente sospeso. La cromatina tranciata deve essere conservata a -80 °C.
