Saggio di immunoprecipitazione della cromatina: una tecnica per studiare le interazioni proteina-DNA nelle cellule

Abstract

Fonte: Fuchs, A. R., et al. Un test di immunoprecipitazione della cromatina per identificare nuovi geni bersaglio NFAT2 nella leucemia linfatica cronica. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive il protocollo per il test di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), che è una tecnica classica per dimostrare le interazioni proteina-DNA. Questa tecnica viene utilizzata per identificare i geni bersaglio nelle cellule di leucemia linfocitica cronica umana.

Protocollo

1. Immunoprecipitazione della cromatina

NOTA: L'immunoprecipitazione della cromatina è stata eseguita con un kit ChIP disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore con modifiche.

1. Calcolare il numero di immunoprecipitazioni (70 μL (cellule Jurkat) o 15 μL (campioni di pazienti) di cromatina tranciata più un anticorpo) e preparare 20 μL di perle rivestite di proteina A per precipitazione in una provetta da 1,5 mL. Lavare le microsfere in 40 μl di 1 tampone ChIP 1 per precipitazione pipettando su e giù, lasciare riposare le perle in una griglia magnetica per 1 minuto e rimuovere il surnatante mediante pipettaggio. Eseguire questo passaggio quattro volte in totale. Alla fine, risospendere le perle nel volume originale con 1x buffer ChIP 1.
2. Per l'immunoprecipitazione vera e propria, utilizzare 10 μg dell'anticorpo αNFAT2 (7A6) per catturare NFAT2 con le sue sequenze bersaglio legate. Utilizzare 2,5 μg di un anticorpo IgG di coniglio (DA1E) come controllo IgG. Preparare le reazioni in provette fresche da 1,5 mL come indicato nella Tabella 1.
   NOTA: Per questo protocollo è importante utilizzare un anticorpo monoclonale ad alta affinità il cui epitopo non sia mascherato durante la fissazione. Gli anticorpi policlonali introducono un ulteriore livello di variazione, rendendo significativamente più difficile interpretare in modo appropriato i risultati ricevuti.
3. Incubare la miscela dal passaggio 1.2 per una notte a 4 °C su una ruota rotante a 6 giri/min.
4. Il giorno successivo centrifugare le provette per 5 s a 7.000 x g nella piccola centrifuga, incubarle in una rastrelliera magnetica per 1 minuto e rimuovere il surnatante per aspirazione. Lavare le perline una volta consecutivamente con ciascuno dei tamponi di lavaggio 1, 2, 3 e 4.
5. A tal fine, risospendere le microsfere in 350 μL di tampone di lavaggio e incubarle per 5 minuti a 4 °C su una ruota rotante a 6 giri/min.
6. Successivamente, centrifugare le provette per 5 s a 7000 x g nella centrifuga piccola. Quindi, metterli per 1 minuto in una griglia magnetica, rimuovere il surnatante e aggiungere il tampone di lavaggio successivo.
7. Dopo l'ultima fase di lavaggio, rimuovere il surnatante mediante pipettaggio, prelevare le perle in 100 μl di tampone di eluizione 1 e incubarle per 30 minuti su una ruota rotante a 6 giri/min.
8. Centrifugare brevemente le provette (5 s a 7000 x g nella centrifuga piccola) e metterle in una griglia magnetica per 1 minuto.
9. Quindi trasferire il surnatante mediante pipettaggio in una nuova provetta da 1,5 mL e aggiungere 4 μL di tampone di eluizione 2.
10. Per creare il controllo di ingresso, mescolare 1 μL di cromatina tranciata con 99 μL di tampone di eluizione 1 e 4 μL di tampone di eluizione 2 (in questa configurazione, ci sono tre provette per paziente: un controllo di ingresso, un controllo IgG e un campione αNFAT2).
11. Incubare i campioni per 4 ore a 65 °C e 1300 giri/min in un agitatore per provette da 1,5 mL. Aggiungere 100 μl di isopropanolo al 100%, agitare e centrifugare i campioni per 5 s a 7000 x g nella piccola centrifuga.
12. Risospendere le microsfere magnetiche disponibili mediante vortice completo, aggiungere 10 μl di perle a ciascun campione e incubare per 1 ora a temperatura ambiente su una ruota rotante a 6 giri/min.
13. Dopo l'incubazione, centrifugare le provette per 5 s a 7000 x g nella centrifuga piccola e posizionarle per 1 minuto in un rack magnetico. Rimuovere il surnatante per aspirazione.
14. Risospendere le perle in 100 μl di tampone di lavaggio 1. Capovolgere le provette per miscelare e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente su una ruota rotante a 6 giri/min.
15. Centrifugare le provette per 5 s a 7000 x g nella centrifuga piccola, posizionarle per 1 minuto in un rack magnetico e rimuovere il surnatante mediante pipettaggio. Ripetere i passaggi 2.13-2.14 con il tampone di lavaggio 2.
16. Successivamente, rimuovere il tampone di lavaggio per aspirazione, risospendere le perle in 55 μL del tampone di eluizione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente sulla ruota rotante a 6 giri/min per eluire il DNA precipitato. Infine, centrifugare le provette per 5 s a 7000 x g nella centrifuga piccola, posizionarle per 1 minuto in un rack magnetico e trasferire il surnatante in nuove provette da 1,5 mL.
    nota: In questo caso, il protocollo può essere potenzialmente sospeso. Il DNA eluito deve quindi essere conservato a -20 °C.

articolo	volume (μL) per IP
5% BSA	6
100 x inibitore della proteasi	3
5 x Buffer ChIP 1	56
cromatina tranciata	x (15 μl o 70 μl)
Sfere magnetiche rivestite di proteina A	20
ChIP seq grado acqua	185-x-y
anticorpo (αNFAT2 o controllo IgG)	y (1,09 μl o 1 μl)
totale	270

Tabella 1: Programma per il pipettaggio dell'immunoprecipitazione della cromatina. L'immunoprecipitazione della cromatina è stata eseguita preparando le reazioni come indicato nella tabella.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo anti-NFAT2	Alexis	1008505	Clone 7A6
Anticorpo anti-NFAT2	Segnalazione cellulare	8032S	Clone D15F1
Anticorpo anti-NFAT2 Grado ChIP	Abcam	ab2796	Clone 7A6
Cremagliera magnetica, magnete DynaMag-15	Termo Scientifico	Codice 12301D	Può essere sostituito con strumenti simili
iDeal Kit ChIp-seq per istoni	Diagenode	C01010059
Centrifuga piccola	Termo Scientifico	Affresco di Heraeus 17	Può essere sostituito con strumenti simili
Agitatore Duomax 1030	Strumenti Heidolph	Codice: 543-32205-00	Può essere sostituito con strumenti simili
Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi Halt (100X)	Termo Scientifico	Codice: 78440
IRDye 680LT Asino anti-coniglio IgG (H + L), 0,5 mg	LI-COR Bioscienze	Codice 926-68023
IRDye 800CW IgG anti-topo di capra (H + L), 0,1 mg	LI-COR Bioscienze	Codice 925-32210
Provetta DNA LoBind 1,5 mL	Eppendorf	22431021
FBS superiore	Merck	S0615
37 % Formaldeide p.a., ACS	Roth	4979.1
1 X PBS	Sigma Aldrich	D8537
M220 Ultrasuoni focalizzati	Covaris	500295
20X Bolt MES SDS Running Buffer	Termo Scientifico	B0002
Soluzione salina tamponata Tris (TBS-10X)	Segnalazione cellulare	#12498
Dispositivo di trasferimento gel iBlot 2	Termo Scientifico	IB21001
iBlot 2 pile di trasferimento, nitrocellulosa, dimensioni regolari	Termo Scientifico	B23001
grande centrifuga	Eppendorf	5804R	Può essere sostituito con strumenti simili