Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Aspirazione del midollo osseo e preparazione del campione
- Preparazione del paziente e del materiale
- Riempire una o due siringhe da 10 ml con lidocaina all'1% utilizzando un ago calibro 16. Sostituire l'ago con un ago calibro 21.
- Metti due gocce di EDTA al 5% sul vetro di un orologio.
- Impostare i vetrini (n=15 con numerazione e data coerenti del paziente) per le preparazioni dello striscio.
- Mettere il paziente in posizione di decubito laterale. Individuare la spina iliaca posteriore superiore e segnare con pen.
nota: In generale, la spina iliaca postero-superiore si trova alla larghezza di una mano distalmente alla cresta iliaca e alla larghezza di una mano lateralmente alla linea mediana. Nelle femmine, la colonna vertebrale vera e propria può essere un po' più laterale, in alcuni uomini un po' più mediale.
- Disinfettare la pelle con clorexidina 0,5-1% in etanolo dall'area bioptica prevista verso l'esterno in cerchi.
- Aprire la confezione dei guanti sterili, indossare i guanti sterili e appoggiare la confezione sul tavolo per creare un campo sterile. Aprire la confezione con l'ago di aspirazione e posizionarla sul campo sterile.
- Infiltrarsi nella pelle e nel tessuto sottocutaneo e infine nel periostio. Al periostio, somministrare la lidocaina in modo tale da anestetizzare un'area di 1 cm di diametro.
nota: Un'adeguata somministrazione di lidocaina al periostio è uno dei fattori più importanti per il comfort del paziente. Verificare se il periostio è stato adeguatamente anestetizzato picchiettando la posizione della biopsia prevista con l'ago introdotto e chiedere se il paziente avverte dolore. Da notare: i bambini sono completamente anestetizzati durante l'intera procedura.
- Tenere l'ago di aspirazione (15 Ga x 2,8") con l'estremità prossimale nel palmo e l'indice contro il lato dell'asta metallica dell'ago vicino alla punta; questa posizione consente un migliore controllo.
- Introdurre l'ago con un movimento rotatorio (alternando rapidamente il movimento pronatore/supinante) attraverso la pelle verso la spina iliaca e portare l'ago a contatto con la spina iliaca posteriore.
- Assicurarsi che l'ago venga introdotto nell'area anestetizzata del periostio; il paziente dovrebbe sentire solo pressione e nessun dolore. Se il paziente avverte dolore, riposizionare l'ago o somministrare più lidocaina.
- Esercitando una pressione delicata ma decisa, far avanzare l'ago ruotandolo con un movimento alternato in senso orario-antiorario. L'ingresso nella cavità midollare è generalmente rilevato da una diminuzione della resistenza.
- Rimuovere lo stiletto dall'ago. Collegare una siringa vuota da 10 ml all'ago.
- Applicare una pressione negativa estraendo lo stantuffo della siringa con una leggera trazione. Avvertire il paziente che potrebbe avvertire una sensazione di crampi e dolore durante l'aspirazione del midollo. Se non vengono rilasciate abbastanza spicole del midollo osseo, è necessario eseguire un'altra aspirazione con un prelievo rapido. La maggior parte delle spicole si troverà nei primi 1-2 ml ottenuti dalla trazione iniziale. Aspirare solo 1-2 mL per evitare di diluire il campione.
nota: La diluizione provocherà l'emodiluizione e potrebbe confondere i risultati della MRD.
- Rimuovere la siringa e riposizionare lo stiletto nell'ago di aspirazione. Espellere una parte del midollo in un vetro d'orologio e il resto in una provetta da 8 mL rivestita di eparina.
nota: Capovolgere ogni provetta subito dopo aver inserito l'aspirato midollare nella provetta del campione per garantire un'adeguata anticoagulazione. La coagulazione del midollo osseo è spesso la causa di materiale inappropriato. È possibile aspirare ulteriore midollo osseo dallo stesso punto, ma preferibilmente l'ago viene fatto avanzare di 5-10 mm prima di prelevare un nuovo aspirato. Preferibilmente non devono essere effettuati più di 2 prelievi per livello di inserimento. Assicurati di contrassegnare i tubi con numeri crescenti che rappresentano la prima, la seconda e/o l'estrazione consecutiva. È regola comune utilizzare il primo disegno per l'analisi diagnostica più rilevante.
- In alternativa, ritrarre l'ago dal punto di inserimento e reintrodurlo nella cavità del midollo a pochi millimetri di distanza dal punto di inserimento originale e ripetere la procedura.
nota: Non aspirare più di 1-2 ml per tiro, per evitare una significativa contaminazione del sangue.
- Ripetere l'operazione tutte le volte che è necessario del materiale. Quando viene aspirato materiale sufficiente per lo specifico protocollo dello studio clinico, rimuovere l'ago del midollo osseo.
nota: In caso di aspirazioni di midollo osseo lente o comunque difficili, può essere utile l'uso di siringhe pre-lavate con anticoagulante. In caso di rubinetto asciutto, eseguire una biopsia del trephine che esula dallo scopo di questo manoscritto.
2. Preparazione degli strisci per l'esame morfologico
- Per una valutazione morfologica ottimale, prelevare le spicole (ad esempio utilizzando una spatola di plastica) dall'aspirato nel vetro dell'orologio e posizionarle su un vetrino.
- Posizionare delicatamente un altro vetrino sopra il vetrino con il midollo e farlo scorrere delicatamente; evitare qualsiasi pressione><.
nota: Solo in caso di spicole midollari molto grandi può essere esercitata una leggera pressione, per diminuire lo spessore della diffusione cellulare. La procedura si avvale dell'aiuto di un assistente in grado di gestire le provette del campione. L'etichettatura accurata delle provette con il numero del paziente e il numero del prelievo sequenziale del midollo osseo è fondamentale.
- Asciugare accuratamente il vetrino, quindi eseguire la colorazione May Giemsa Grünwald (vedi tabella dei materiali). Esaminare al microscopio ottico la morfologia (vedi Figura 1).
NOTA: La Figura 1A mostra gli strisci di midollo osseo sano costituiti da diversi tipi di cellule funzionali, mentre la Figura 1B è un paziente con LMA con blasti prevalentemente leucemici. Per definire meglio il carico leucemico residuo, è necessario eseguire l'immunofenotipizzazione.
