Coltura e raccolta di cloni di HSPC: un metodo per ottenere i cloni di HSPC selezionati singolarmente

Abstract

Fonte: Huber, A. R., et al. Caratterizzazione del carico mutazionale e della composizione clonale del sangue umano. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive il protocollo per isolare le HSPC dal midollo osseo e selezionarle utilizzando una tecnica di smistamento cellulare attivata fluorescente, che è un metodo per ottenere HSPC singolarmente selezionate. Coltiviamo queste cellule selezionate per ottenere cloni di HSPC.

Protocollo

1. Isolamento, ordinamento e cultura HSPC

1. Centrifugare a 1-2 x 10⁷ cellule mononucleate per 5 minuti a 350 x g e risospendere in 50 μL di tampone FACS. Risospendere il pellet cellulare in 100 μL di soluzione colorante anti-CD3 (diluizione 1:100 dell'anticorpo anti-CD nel tampone FACS). Trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga.
   NOTA: Quando si esegue la selezione con >2 x 10⁷ cellule, aumentare di conseguenza i volumi della miscela di anticorpi e del tampone FACS.
2. Preparare 50 μl di miscela colorante 2x HSC secondo la ricetta mostrata nella Tabella 1
3. Miscelare 50 μl di soluzione cellulare con la miscela di colorazione HSC preparata e incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) o per 1 ora su ghiaccio per consentire agli anticorpi di legarsi.
4. Lavare le celle aggiungendo 1 mL di tampone FACS e pellet centrifugando per 5 minuti a 350 x g.
5. Risospendere le cellule in 300 μL di tampone FACS e filtrare la sospensione cellulare attraverso una provetta di polistirene da 5 mL con tappo di filtro cellulare da 35 μm per rimuovere i grumi cellulari prima della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).
6. Preparare 25 mL di terreno di coltura HSPC, composto da 1x terreno SFEM integrato con 100 ng/mL di SCF, 100 ng/mL di Flt3, 50 ng/mL di TPO, 10 ng/mL di IL-3, 20 ng/mL di IL-6 e 100 ng/mL di formulazione antibiotica (vedere la Tabella dei materiali).
7. Riempire una piastra di coltura cellulare da 384 pozzetti con 75 μL di terreno di coltura HSPC in ciascun pozzetto.
   NOTA: Per evitare l'evaporazione del terreno nei pozzetti esterni, riempire i pozzetti esterni con 75 μl di acqua sterile o PBS e non utilizzare questi pozzetti per la selezione cellulare.
8. Smistamento di singoli HSPC
   1. Impostare i cancelli per la selezione HSPC in base a un controllo non colorato (HSC selezionate singolarmente) e a 10.000 cellule dal campione colorato. Un risultato rappresentativo per l'impostazione dei cancelli è illustrato nella Figura 1. Gate singole celle disegnando un gate attorno alla frazione lineare FSC-altezza vs. FSC-area. Utilizzare la frazione di controllo non colorata per disegnare il cancello per ^{la frazione di} lignaggio. Disegna i gate per le cellule CD34⁺ e caratterizza ulteriormente questo sottoinsieme impostando un gate specifico per le cellule CD38^- CD45RA-.
   2. Caricare la piastra a 384 pozzetti sulla macchina FACS e smistare le singole cellule.
      NOTA: Se applicabile alla macchina FACS, attivare l'opzione per mantenere i dati di ordinamento dell'indice per abilitare il ritracciamento delle celle ordinate.
9. Coltura di CSA differenziate singolarmente
   1. Trasferire direttamente la piastra da 384 pozzetti in un incubatore umidificato a 37 °C con CO₂,
      al 5% nota: Per evitare l'evaporazione durante la coltura, avvolgere la piastra di coltura a 384 pozzetti (con coperchio) in un involucro di polietilene trasparente.
   2. Conservare la piastra a 384 pozzetti nell'incubatore per 3-4 settimane fino alla comparsa di cloni visibili. Le immagini rappresentative della coltura clonale sono illustrate nella Figura 2. In base alle condizioni del materiale in ingresso, il 5%-30% delle cellule selezionate si espanderà clonalmente.

anticorpo	volume [μL]
BV421-CD34	5
FITC-Mix di lignaggio (CD3/14/19/20/56)	5
PE-CD38	numero arabo
APC- CD90	0,5
PerCP/Cy5.5 - CD45RA	5
PE/Cy7- CD49f	1
FITC -CD16	1
FITC-CD11	5
Tampone FACS	25,5

Tabella 1: Miscela di smistamento HSC.Viene mostrata una tabella che indica le diluizioni degli anticorpi utilizzati per selezionare le HSC.

2. Raccolta di cloni HSPC

1. Dopo 4 settimane di coltivazione, determinare quali pozzetti hanno una confluenza del 30% o superiore.
2. Riempire (per ogni crescita clonale) microprovette da 1,5 mL con 1 mL di BSA all'1% in PBS ed etichettare la provetta in base al pozzetto corrispondente.
3. Pre-bagnare il puntale di una pipetta con l'1% di BSA in PBS per ridurre al minimo il numero di cellule che si attaccano al puntale della pipetta.
4. Pipettare su/giù il terreno nel pozzetto ferocemente (almeno 5 volte) con una pipetta da 200 μl (impostata a 75 μl) e raschiare il fondo del pozzetto per allentare le cellule nel pozzetto e raccogliere la sospensione cellulare nella microprovetta etichettata corrispondente al pozzetto.
5. Prelevare 75 μl di BSA fresco all'1% in PBS e ripetere il pipettaggio nel pozzetto per garantire il massimo assorbimento delle cellule.
   NOTA: Le cellule coltivate clonalmente possono attaccarsi al fondo del pozzetto. Ispezionare i pozzetti utilizzando un microscopio a luce inversa standard per assicurarsi che tutte le cellule siano state raccolte.
6. Se tutti i pozzetti con confluenza del >30% sono stati raccolti, riposizionare la piastra da 384 pozzetti nell'incubatore. Le colture clonali possono proliferare fino a 5 settimane.
7. Ruotare la sospensione cellulare per 5 minuti a 350 x g. Dovrebbe essere visibile un piccolo pellet.
8. Rimuovere con cautela tutto tranne circa 5 μl di surnatante. I pellet cellulari possono essere congelati a -20 °C e conservati per diversi mesi prima dell'isolamento del DNA.

Risultati

Figura 1: Diagramma di flusso che illustra la procedura sperimentale basata sul materiale in ingresso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
CD11c FITC	BioLeggenda	301603	Clone 3.9
CD16 FITC	BioLeggenda	302005	Clone 3G8
CD3 BV650	BioLeggenda	300467	Clone UCHT1
CD34 BV421	BioLeggenda	343609	561
CD38 PE	BioLeggenda	303505	Clone HIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5	BioLeggenda	304121	Clone HI100
CD49f PE/Cy7	BioLeggenda	313621	Clone GoH3
Processore APC CD90	BioLeggenda	328113	Clone 5E10
Cell Strainer Provetta da 5 mL	Corning	352235
Piastra CELLSTAR, 384w, 130 μL, fondo F, TC, coperchio	Greiner	781182
Legante Flt3 umano, grado premium	Miltenyi Biotech	130-096-479	Ricostituente in aliquote monouso (25 μL) a 100 μg/mL in BSA allo 0,1% in PBS
IL-3 ricombinante umana (espressa da E. coli)	Tecnologie delle cellule staminali	Codice 78040.1	Ricostituisci in aliquote monouso (2,5 μL) a 100 μg/mL in BSA allo 0,1% in PBS
IL-6 ricombinante umana (E. coliexpressed)	Tecnologie delle cellule staminali	78050.1	Ricostituente in aliquote monouso (5 μL) a 100 μg/mL in BSA allo 0,1% in PBS
SCF umano, di qualità premium	Miltenyi Biotech	130-096-695	Ricostituente in aliquote monouso (25 μL) a 100 μg/mL in BSA allo 0,1% in PBS
TPO umano, qualità premium	Miltenyi Biotech	Codice 130-095-752	Ricostituente in aliquote monouso (12,5 μL) a 100 μg/mL in BSA allo 0,1% in PBS
Lignaggio (CD3/14/19/20/56) FITC	BioLeggenda	348701	Cloni: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
Pbs			Prodotto presso la struttura dell'Istituto. È possibile utilizzare anche il PBS disponibile in commercio
Primocina	Invivogen	formica-pm-1	Formulazione di antibiotici