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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
Isolamento di cellule c-Kit+ dal midollo osseo
- Sacrificare i topi secondo le linee guida istituzionali.
NOTA: Qui, i topi sono stati esposti all'anidride carbonica (CO2) a una velocità di flusso raccomandata dall'AVMA fino a quando la morte non è stata determinata dalla cessazione della respirazione e del battito cardiaco, seguita dalla lussazione cervicale.
- Raccogli le ossa delle zampe dal topo: due femori, due tibie, due iliache. Pulisci tutti i tessuti dalle ossa raschiando via con un bisturi. Metti le ossa delle gambe in 1x PBS freddo su ghiaccio - 5 ml in una provetta da 15 ml. Versare il contenuto del tubo in un mortaio e schiacciarlo con un pestello.
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta da 50 mL con tappo a vite con una pipetta da 10 mL collegata, utilizzando una pipetta. Lavare il mortaio e il pestello più volte con 1x PBS freddo, raccogliendo e aggiungendo la sospensione cellulare alla provetta da 50 mL. Centrifugare il midollo osseo a 1.200 x g a 4 °C per 5 min. Rimuovere il surnatante tramite un aspirapolvere con una pipetta di vetro attaccata. Sospendi il pellet cellulare in 5 mL di 1x PBS con una pipetta.
- Con una pipetta, aggiungere lentamente il midollo osseo in sospensione alla sommità di 5 mL di polisaccarosio a temperatura ambiente (la temperatura è critica), facendo molta attenzione a non disturbare l'interfaccia. Centrifugare a 400 x g a temperatura ambiente per 20 min con il freno spento.
- Raccogliere l'interfaccia della cella mononucleato totale (TMNC) torbida con una pipetta e inserirla in una nuova provetta da 15 mL. Portare il volume a 10 ml con 1 PBS per il lavaggio, prendendo 20 μl per il conteggio, e centrifugare a 1.200 x g a 4 °C per 5 minuti. Scartare il surnatante e conservare il pellet sul ghiaccio per il passaggio 4.6.1.
- Eseguire l'isolamento cellulare c-Kit+.
- Seguire un protocollo del kit di microsfere per l'isolamento cellulare c-Kit+. Risospendere il pellet di cella in 80 μl di 1x PBS + EDTA + BSA in 107 cellule. Alla sospensione cellulare, aggiungere 20 μL di CD117 MicroBeads/107 cellule totali. Mescolare bene con agitazione e incubare per 10 minuti a 4 °C. Portare il volume fino a 10 mL aggiungendo 1x PBS + EDTA + BSA e centrifugare a 1.200 x g a 4 °C per 5 min.
- Rimuovere il surnatante tramite un vuoto e sospendere il pellet di cella in 500 μL/10 8 celle totali in 1x PBS + EDTA + BSA. Utilizzando il supporto magnetico con la colonna magnetica collegata, aggiungere 3 mL di 1x PBS + EDTA + BSA e lasciarlo fluire per gravità in una provetta di raccolta da 15 mL.
- Una volta terminato il passaggio del primo tampone attraverso la colonna, aggiungere la sospensione cellulare alla colonna, consentendole di fluire per gravità nella provetta di raccolta da 15 mL. Questo flusso è la frazione cellulare indesiderata.
- Lavare la colonna 3 volte con 3 mL 1x PBS + EDTA + BSA ogni volta, lasciandola fluire per gravità nella provetta di raccolta. Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla sulla parte superiore di una provetta da 15 mL.
- Aggiungere 5 mL di 1x PBS + EDTA + BSA e sciacquarlo immediatamente con lo stantuffo fornito con la colonna. Rimuovere lo stantuffo e ripetere il risciacquo con altri 5 ml di 1x PBS + EDTA + BSA. Conta le celle nel volume totale utilizzando metodi standard.
- Centrifugare le cellule a 1.200 x g a 4 °C per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in IMDM completo (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] + mSCF [50 ng/mL] + ligando FLT3 [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) per la coltura. Coltura di queste cellule per una notte in 2 x 10,6 cellule/1 mL di terreno completo IMDM cellulare, mettendole in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2.