Trasduzione retrovirale-mediata: un metodo per introdurre il gene bersaglio nelle cellule tumorali

Abstract

Fonte: Kesarwani, M., et al. Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza da oncogeni. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive il protocollo per la convalida genetica trasferendo geni bersaglio utilizzando retrovirus in linee cellulari di leucemia mieloide cronica. I retrovirus agiscono come mediatori per trasferire materiale genetico nella cellula leucemica attraverso il processo chiamato trasduzione, che consente l'espressione a lungo termine del gene bersaglio. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi cellula bersaglio per la convalida genetica e lo sviluppo terapeutico.

Protocollo

1. Trasduzione

1. Trasfezione di plasmidi retrovirali
   1. Scongelare le cellule HEK293 il pomeriggio prima in un bagno d'acqua impostato a 37 °C. Centrifugare la crioprovetta contenente le cellule HEK a 435 x g a temperatura ambiente per 3 minuti. Rimuovere il surnatante tramite un vuoto e sospendere il pellet cellulare in 1 mL di DMEM integrato con il 10% di FBS, penicillina, streptomicina e glutammina.
   2. Contare le cellule e aggiungere il volume appropriato in una piastra trattata da 10 cm (~4 x 10⁶ HEK293T cellule). Aggiungere 14 mL di terreno DMEM 10 al piatto e mescolare bene facendo scorrere verso l'alto e verso il basso per una distribuzione uniforme. Mettere la capsula in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO₂ per una notte.
   3. La mattina successiva, controlla la confluenza delle cellule al microscopio ottico invertito (il 50% o più funziona bene).
   4. Combinare il DNA (plasmide retrovirale desiderato), PclEco (plasmide di imballaggio), 2 M CaCl₂ e H₂0 in una provetta da 1,5 mL (= 500 μL) utilizzando una micropipetta nelle seguenti quantità: 7,5 μg di DNA (BCR-ABL1-YFP), 7,5 μg di pCLeco, 62 μL di 2 M CaCl₂ e acqua fino a un volume finale di 500 μL. Aggiungere 500 μL di 2x HBS a un'altra provetta da 1,5 mL.
   5. Aggiungere la miscela di DNA goccia a goccia alla provetta da 1,5 mL contenente 500 μl di 2x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES e 1,5 mM Na₂HPO₄) durante la miscelazione. Per ottenere questo risultato, impostare un vortice alla velocità più bassa e tenere il tubo HBS su di esso per una miscelazione costante mentre si aggiunge la miscela di trasfezione.
   6. Lasciare incubare la miscela di trasfezione per 20–30 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, aggiungere 25 nM di clorochina alle cellule HEK e rimetterle nell'incubatore. Dopo l'incubazione, aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia alle cellule HEK e, quindi, agitare delicatamente il terreno per mescolare la miscela di trasfezione in tutta la piastra.
   7. Incubare le cellule con la miscela per ~8 ore in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂. Sostituire il terreno su queste celle aggiungendo molto lentamente 14 ml di terreno DMEM 10 fresco. Il pipettaggio lento contro la parete della piastra aiuta a prevenire la rimozione delle cellule HEK. Incubare le cellule per una notte nell'incubatore a 37 °C, 5% CO₂.
   8. Raccogliere il surnatante virale con una siringa da 10 ml, aspirare il surnatante nella siringa e collegare il filtro della siringa da 0,45 μm. Immergere il surnatante virale in un nuovo tubo di raccolta. Prendi la prima raccolta di surnatante virale ~ 16 ore dopo.
2. Concentrazione virale e trasduzione della fibronectina
   1. Aggiungere 2 mL di un frammento di fibronectina umana ricombinante da 0,1 mg in 1x PBS a piastre di coltura a 6 pozzetti non trattate. Preparare la quantità di fibronectina necessaria, che dipende dal numero di cellule e dai genotipi. Un pozzetto può trasdurre in modo sufficiente 10 milioni di cellule c-Kit+. Incubare la piastra per una notte a 4 °C.
   2. Il giorno successivo, rimuovere la fibronectina dai pozzetti con una pipetta, pipettare 2 ml di BSA sterile al 2% in 1x PBS per bloccare la piastra e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il BSA con l'aspirapolvere e lavarlo accuratamente pipettando 2 ml di 1x PBS, quindi rimuoverlo con l'aspirapolvere.
   3. Aggiungere immediatamente il surnatante virale appena raccolto e filtrato (a 0,45 μm) fino a 5 mL. Centrifugare a 435 x g a 32 °C per 2 h. Rimuovere il surnatante con l'aspirapolvere e ripetere questo passaggio con altro surnatante virale appena raccolto e centrifugare di nuovo. Rimuovere il surnatante tramite aspirapolvere e lavare i pozzetti aggiungendo 2 ml di 1x PBS; Quindi, rimuovilo con l'aspirapolvere.
   4. Aggiungere le cellule di topo c-Kit+ che sono state coltivate durante la notte facendo girare le cellule e risospendendo il pellet in IMDM completo, per la coltura. Coltivare queste cellule durante la notte in 2 x 10-6 cellule/1 mL di terreno completo IMDM cellulare ponendole in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂) nei pozzetti rivestiti viralmente, mescolando bene le sospensioni cellulari e pipettandole nella piastra di fibronectina concentrata ora virale. Centrifugare a 1.200 x g a 25 °C per 90 min. Mettere le celle in un incubatore a 37 °C con CO2 al 5%.
   5. 48 ore dopo la trasduzione, pellettare le cellule mediante centrifugazione a 1.200 x g a 4 °C per 5 minuti e risospenderle nel tampone FACS #1 (1x PBS + 0,5% BSA) a 6 x 10⁶/mL. Determinare la percentuale di cellule BCR-ABL1 positive misurando la percentuale di YFP positive utilizzando la citometria a flusso.
   6. Acquisire eventi con la procedura standard. Innanzitutto, gate le cellule vive in base alla dispersione diretta e laterale. Quindi, gate le cellule vive YFP positive escludendo le cellule YFP-negative determinate dal controllo negativo (Figura 1).

Risultati

Figura 1: FACS che mostra la frequenza delle cellule YFP+ dal sangue di un topo trapiantato e di un topo WT (controllo negativo). I pannelli superiori mostrano un grafico a dispersione delle celle e del gating. I pannelli inferiori mostrano gli istogrammi di YFP rispetto alla dispersione laterale. Le cellule con un MFI di >10³ sono stat...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
Frammento di fibronectina umana ricombinante con retronectina	Takara	T100B
FBS	Atlanta biologico	S11150
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
L-Glutammina	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL di brodo acquoso
HEPES	sigma	H7006
Pbs	Corning	21040CV
Na2HPO4.7H2O	sigma	S9390
cloruro di calcio	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
Edta	Ambion	AM9261
Bsa	sigma	Codice: A7906
Saggio cellulare di avvio della coltura umana a lungo termine	Tecnologie Stemp Cell
Contatore di celle automatizzato TC-10	Bio-RAD
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	Fatto in casa
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Fatto in casa
ROSACreERT2	Laboratorio Jackson
C57Bl/6	Laboratorio Jackson
Cellule CML-CD34+ e CD34+ normali	Ospedale universitario, Università di Cincinnati
LSR II (Analizzatore FACS)	Bd
Fortessa I (analizzatore FACS)	Bd
FACSAriaII (Smistatore FACS)	Bd
Incubatore a CO2 NAPCO serie 8000 WJ	Termo scientifico
Rotore a benna oscillante cetrifugo 5810R	Eppendorf
1/2 cc Siringa da insulina Lo-Dose u-100 28 G1/2	Becton Dickinson	Becton Dickinson
Idrocortisone Sodio Emisuccinato	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 7904
GM-CSF	Prospettiva	CYT-221
G-SCF	Prospettiva	CYT-220
IL-3 umana	Prospettiva	CYT-210
SCF umano	Prospettiva	CYT-255
Eritropoieina	Amgen	5513-267-10
BD Perm/Wash (permeabilizzazione e soluzione di lavaggio per flusso fosfo)	Bd	554723
BD Cytofix/Cytoperm (Soluzione fissante e permeabilizzante)	Bd	554714
BD Pharm Lyse	Bd	555899
Piastra di stabilizzazione per celle in nylon da 70 μm	Becton Dickinson	Codice 352350
Filtro a disco acro da 0,45 μM	sudario	2016-10