Saggio CFU a base di metilcellulosa: un metodo per determinare l'effetto dei composti antitumorali sulla formazione di colonie nelle cellule leucemiche

Abstract

Fonte: Kesarwani, M., et al. Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza da oncogeni. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive il protocollo per l'unità di formazione di colonie a base di metilcellulosa o saggio UFC, che aiuta a identificare e contare il numero di colonie formate da cellule leucemiche in risposta al trattamento con composti antitumorali.

Protocollo

1. Saggi delle unità formanti colonie

1. Scongelare la metilcellulosa con citochine per topi a temperatura ambiente per 1-2 ore. Aliquotare 3 mL di metilcellulosa in una provetta FACS utilizzando una siringa da 5 mL senza ago. Ordina le celle YFP-positive su un selezionatore di cellule.
2. Far girare le celle verso il basso e sospendere il pellet in un mezzo completo IMDM. Contare le cellule da placcare e diluirle per ottenere 5.000 cellule YFP-positive in 100 μL di terreno completo IMDM.
3. Aggiungere 100 μl di sospensione cellulare contenente 5.000 cellule YFP-positive e gli inibitori appropriati a 3 mL di metilcellulosa. Agitare al massimo per mescolarlo per 10-30 s.
4. Dopo che la maggior parte delle bolle d'aria è fuoriuscita, utilizzare una siringa da 1 ml per placcare 1 ml di terreno in tre piastre replicate da 3 cm, espellendo il terreno su un lato e inclinando lentamente la piastra con un movimento circolare per distribuirla uniformemente.
5. La concentrazione finale degli inibitori da utilizzare è imatinib a 3 μM, DFC a 0,2 μM e BCI a 0,5 μM, da soli o in combinazione. Ove opportuno, eliminare il c-Fos placcando le cellule con 4-idrossitamoxifene (1 μg/mL) aggiunto alla metilcellulosa.
6. Dopo l'impiattamento, mettere le piastre in una grande capsula di Petri con una capsula aperta contenente 2 ml di acqua sterile al centro. Coprire la capsula di Petri grande e incubare con cura all'incubatore a 37 °C, 5% CO₂. Registra il numero di colonie dopo una settimana di piastratura contando il numero totale di colonie al microscopio.
7. Analizzare alcune colonie da piastre appropriate per la delezione di c-Fos mediante PCR. Raccogli le colonie succhiandole con una punta P1000. Spostare le cellule in 500 μl di 1x PBS lavando più volte la punta nel PBS. Centrifugare le sospensioni cellulari a 6.000 x g per 1 minuto ed estrarre il DNA dal pellet cellulare utilizzando un kit di isolamento del DNA genomico.
8. Utilizzare il DNA genomico per la PCR utilizzando i primer mFos-FP3 e mFos-RP5. Analizzare i prodotti PCR su un gel di agarosio al 2% e creare immagini utilizzando un sistema di documentazione su gel.
9. Per una presentazione grafica delle colonie, colorare le colonie, utilizzando il cloruro di iodonitrotetrazolio. Sciogliere 10 mg di cloruro di iodonitrotetrazolio in 10 mL di acqua per ottenere una soluzione di 1 mg/mL. Filtro sterilizzare la soluzione utilizzando un Luer lock con un filtro da 0,2 μm collegato a una siringa da 10 mL in condizioni sterili in una cappa di coltura tissutale.
10. Nella cappa di coltura tissutale, aggiungere 100 μl di soluzione colorante goccia a goccia intorno alla piastra CFU; fare attenzione a non far scivolare o disturbare le colonie. Incubare le piastre per una notte in un incubatore per colture cellulari a 37 °C, 5% CO₂. Le colonie diventeranno marrone rossastro scuro. Utilizzando uno sfondo bianco nella cappa di coltura di tessuti sterili, scattare foto della piastra CFU colorata.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
MethoCult GF M3434 (metilcellulosa per topi CFU)	cellula staminale	Telefono 3434
4-idrossitamoxifene	sigma	H6278
SCF murino ricombinante	Prospettiva	CYT-275
Legante murino ricombinante Flt3	Prospettiva	CYT-340
IL-6 murina ricombinante	Prospettiva	CYT-350
IL-7 murina ricombinante	Peprotech	217-17
Dfc	Laboratori LKT Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	Nuova Zelanda-06-195
Imatinib	LC Laborator	I-5508
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
1/2 cc Siringa da insulina Lo-Dose u-100 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Cloruro di iodonitrotetrazolio	sigma	I10406
strumenti
Incubatore a CO2 NAPCO serie 8000 WJ	Termo scientifico
Rotore a benna oscillante cetrifugo 5810R	Eppendorf
C-1000 Termociclatore	Bio-RAD
ChemiDoc Imaging System (sistema di imaging per gel e western blot)	Bio-RAD	17001401
topi
ROSACreERT2	Laboratorio Jackson
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/	Fatto in casa
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Fatto in casa