Selezione immunomagnetica negativa: un metodo per purificare le cellule B dalle cellule mononucleate del sangue periferico

Abstract

Fonte: Serra S. et al. Saggio basato su HPLC per monitorare il metabolismo nucleotidico/nucleosidico extracellulare nelle cellule di leucemia linfocitica cronica umana. J. Vis. Exp. (2016)

Il video spiega un modo per purificare le cellule B mediante targeting immunomagnetico e separazione dalla sospensione di cellule mononucleate del sangue periferico. Il metodo prevede la marcatura di tipi di cellule indesiderate con anticorpi o ligandi specifici (legati a particelle magnetiche) che hanno come bersaglio specifiche proteine della superficie cellulare, da esaurire dalla sospensione cellulare eterogenea mediante separazione magnetica.

Protocollo

1. Purificazione delle cellule B leucemiche mediante isolamento negativo

1. Risospendere 10⁷ PBMC/ml in PBS 0,1 % albumina sierica bovina (BSA) 2 mM EDTA, pH 7,4 (tampone di isolamento).
2. Aggiungere 10 μg di anticorpi primari monoclonali di topo anti-CD3, -CD14 e -CD16 per^10-7 cellule e incubare per 30 minuti a 4 °C.
3. Lavare le celle con il tampone di isolamento e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
4. Risospendere le cellule nel tampone di isolamento a 10⁷ PBMC/ml.
5. Prima di incubare con le cellule, risospendere le perle magnetiche IgG anti-topo di pecora nella fiala. Trasferire 100 μl di perle per 10-7 celle in una provetta.
6. Aggiungere 1 mL di tampone isolante e posizionare la provetta in un supporto magnetico per 1 minuto. Eliminare il surnatante con una pipetta da 5 ml.
7. Rimuovere il tubo dal magnete e risospendere le perle lavate in 100 μl di tampone di isolamento.
8. Incubare^10-7 cellule con 100 μl di biglie magnetiche per 30 minuti a 4 °C con inclinazione e rotazione delicate.
9. Posizionare la provetta nel supporto magnetico per 2 minuti e trasferire il surnatante con le cellule CD19⁺/CD5⁺ non legate in una nuova provetta con una pipetta da 5 ml.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sangue umano
purificato anti-CD3, -CD14, -CD16	Realizzato internamente		monoclonale di topo
Dynabeads pecora anti-topo IgG	Invitrogen	Codice 11031
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Amresco	E404-200SCHEDE	Compresse
albumina sierica bovina (BSA)	Biografia ID	1000-70	grado standard
buffer di isolamento			PBS 0,1% BSA 2 mM EDTA, pH 7,4
Magnete DynaMag-15	Invitrogen	Codice 12301D	Separatore di microsfere magnetico dinale