1. Preparazione di soluzioni madre standard e inibitori
- Per preparare l'AMP, pesare 0,00345 g di AMP e scioglierlo in 5 ml di terreno privo di siero per ottenere una soluzione standard di 2 mM di AMP.
- Per preparare ADO, pesare 0,00265 g di ADO e scioglierlo in 5 ml di terreno privo di siero per ottenere una soluzione standard di 2 mM di ADO.
- Per preparare l'INO, pesare 0,00268 g di INO e scioglierlo in 5 ml di terreno privo di siero per ottenere una soluzione standard di 2 mM di INO.
- Preparare una soluzione da 400 μM di AMP, ADO e INO mescolando 1 ml della soluzione madre da 2 mM in 4 ml di terreno privo di siero (volume finale di 5 ml).
- Effettuare una diluizione 1:4 di ciascuna soluzione standard da 400 μM per ottenere una concentrazione di 100 μM pipettando 500 μl della soluzione da 400 μM in 1.500 μl di terreno privo di siero (volume finale di 2 ml).
- Preparare diluizioni seriali di ciascun composto in terreno privo di siero per ottenere le seguenti concentrazioni: 100 μM - 50 μM - 25 μM - 10 μM - 5 μM - 2,5 μM - 1 μM - 0,5 μM - 0,25 μM.
Nota: Ad esempio, pipettare 1 ml della soluzione da 100 μM in 1 ml di terreno privo di siero (diluizione 1:2) per ottenere una concentrazione di 50 μM e procedere con le diluizioni rimanenti.
- Preparare una soluzione madre da 10 mM di APCP disciolto in PBS; aliquotare e conservare a - 30 °C.
- Preparare 10 mM di EHNA cloridrato, dCF e dipiridamolo disciolti in dimetilsolfossido (DMSO); aliquotare e conservare a -30 °C.
2. Programma il Metodo HPLC
- Preparare un tampone 7 mM di acetato di ammonio sciogliendo 0,770 g di acetato di ammonio in 2 L di acqua a doppia deionizzazione (tampone A). Regolare a pH 3,0 con acido cloridrico.
- Preparare un flacone di vetro contenente almeno 2 L di acetonitrile ultrapuro per HPLC (Buffer B) e collegare la colonna di protezione e la colonna all'HPLC.
Nota: le colonne e i buffer sono in posizione RT durante l'uso.
- Accedere al software HPLC e selezionare il pulsante "Sfoglia progetto". Vai al menu "file" e seleziona "nuovo metodo" e poi "metodo strumento".
- Programmare il metodo della colonna di equilibratura come da Tabella 1. Impostare una portata di 1,00 ml/min e programmare il rivelatore UV per leggere a 260 nm. Salvare il metodo dello strumento e selezionare nuovamente "nuovo metodo" dal menu "file" e poi "set di metodi". Scegliere il metodo dello strumento precedentemente salvato e salvare il set di metodi corrente con lo stesso nome.
- Ripetere il passaggio 2.3 per programmare il metodo di esecuzione del campione indicato nella Tabella 2. Impostare una portata di 1,00 mL/min e programmare il rivelatore UV per leggere a 260 nm. Salvare il metodo dello strumento e ripetere la stessa procedura descritta al punto 4.4 per salvare il set di metodi.
- Seleziona il pulsante "esegui campioni", scegli "nuovo metodo di set di campioni" dal menu "file".
- Selezionare l'opzione "vuoto" e inserire il numero della fiala (nell'autocampionatore), il nome del campione, il volume di iniezione (50 μl). Selezionare il set di metodi salvato in precedenza per la colonna "set di metodi" e inserire il tempo di esecuzione totale (min).
Nota: Inserire il metodo della colonna di equilibratura (Tabella 1) nella colonna "set di metodi" prima di ogni esecuzione del campione e inserire il tempo di esecuzione totale (min).
3. Generazione di una curva di calibrazione standard per ogni composto
- Iniettare 50 μl di bianco (terreno specifico privo di siero, che non contiene adenosina deaminasi) e di ciascun campione standard seguendo i metodi descritti nella Tabella 1 e nella Tabella 2.
- Utilizzare il metodo della colonna di equilibratura (Tabella 1) prima di ogni esecuzione del campione e impostare le condizioni del gradiente descritte nella Tabella 2 per ottenere un'adeguata separazione dei picchi. Fare riferimento alla Tabella 3 per i tempi di ritenzione riportati di AMP, ADO e INO in queste condizioni HPLC.
- Determinare l'area di picco di AMP, ADO e INO a diverse concentrazioni scegliendo il pulsante "processo" nel software HPLC e successivamente l'opzione "integra". In alternativa, selezionare manualmente i punti di inizio e fine di ogni picco.
- Tracciare le aree dei picchi rispetto alla concentrazione nominale di ciascuno standard per ottenere la curva di calibrazione a nove punti (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 μM).
- Calcola l'equazione di una retta per AMP, ADO e INO: y = mx + b,
dove x è la concentrazione di μM e y corrisponde all'area del picco.
| Ore | Portata (ml/min) | %A | %B |
| Ore 1.00 | 100 | 0 |
| 1.24 | Ore 1.00 | 100 | 0 |
| 6.22 | Ore 1.00 | numero arabo | 98 |
| Ore 18.65 | Ore 1.00 | numero arabo | 98 |
Tabella 1: Metodo della colonna di equilibrio. Rappresentazione schematica delle variazioni di solvente per l'equilibrio della colonna. Tampone A: 7 mM di acetato di ammonio, pH 3,0. Tampone B: acetonitrile.
| Ore | Portata (ml/min) | %A | %B |
| Ore 1.00 | 0 | 100 |
| 3.74 | Ore 1.00 | 0 | 100 |
| Ore 13.71 | Ore 1.00 | 15 | 85 |
| Ore 17.00 | Ore 1.00 | 100 | 0 |
| Ore 20.00 | Ore 1.00 | 100 | 0 |
Tabella 2: Esegui il metodo di esempio. Rappresentazione schematica delle variazioni del solvente per la misurazione HPLC di composti purinici. Tampone A: 7 mM di acetato di ammonio, pH 3,0. Tampone B: acetonitrile.
| Tempo di conservazione | λmax |
| Amp | 8.00 minuti | 260 |
| Ino | 11.00 minuti | 260 |
| Ado | 11.90 minuti | 260 |
Tabella 3: Tempi di ritenzione dei composti purinici. Tempi di ritenzione tipici osservati per AMP, ADO e INO. Il rivelatore UV è programmato per leggere a 260 nm.
4. Pretrattamento con gli inibitori e incubazione con il substrato (AMP)
- Per testare il consumo di AMP, la generazione di ADO e INO senza inibizione dei trasportatori CD73, ADA e nucleosidici, risospendere le cellule CLL purificate 2 x 106 CD19+/CD5+ in 250 μl di terreno privo di siero e le cellule per piastre in una piastra a 48 pozzetti (o in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml).
- Aggiungere 250 μl di AMP da 400 μM o inibitori di AMP plus per ottenere una concentrazione finale di 200 μM di AMP. Includere una condizione in assenza del substrato da utilizzare come campione bianco.
- Incubare da 30 a 60 minuti a 37 °C.
- Al termine del tempo di incubazione, raccogliere 500 μl di surnatanti in provette da microcentrifuga fredde (su ghiaccio) e centrifugare immediatamente a 17.000 x g a 4 °C per 5 minuti.
- Trasferire i surnatanti in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 ml e conservarli immediatamente a -80 °C oppure procedere alla preparazione del campione per le esecuzioni HPLC.
5. Preparazione dei campioni per l'HPLC
- Filtrare i surnatanti in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 ml con i filtri per siringhe da 0,2 μm. Utilizzare siringhe da 1 ml per filtrare.
- Se il sistema HPLC è dotato di un autocampionatore, preparare le provette di vetro per l'HPLC e utilizzare i microinserti da 0,1 ml per piccoli volumi di campione.
- Trasferire almeno 100 μl di campione nel flaconcino di vetro con una micropipetta o una pipetta di vetro Pasteur. Fare attenzione a trasferire senza bolle e chiudere la fiala con il tappo a vite.
- I campioni sono ora pronti per l'analisi da parte di RP-HPLC.
6. Misurazioni HPLC delle purine
- Selezionare il pulsante "esegui campioni"; scegliere "nuovo metodo di set di campioni" dal menu "file".
- Selezionare l'opzione "vuoto" e indicare: il numero della fiala (nell'autocampionatore), il nome del campione, il volume di iniezione (50 μl).
- Selezionare il metodo della colonna di equilibratura e il metodo del campione di esecuzione descritti rispettivamente nella Tabella 1 e nella Tabella 2 per tutte le esecuzioni di vuoto e di esempio che seguono.
nota: Impostare il metodo della colonna di equilibratura (Tabella 1) prima di ogni esecuzione del campione.
- Iniettare 50 μl di bianco (terreno privo di siero) e di ciascun campione.
- Determinare la concentrazione di purine in ciascun campione, quantificare l'AMP, l'ADO e l'INO ottenendo le aree di picco ai tempi di ritenzione descritti nella Tabella 3.
- Seleziona il pulsante "Elabora" e poi l'opzione "Integra". In alternativa scegliere manualmente i punti di inizio e fine di ogni singolo picco per ottenere la misura dell'area. Questo viene fatto tracciando una linea tra i punti di inizio e fine del picco.
- Determinare la concentrazione di μM applicando l'equazione ottenuta per la curva standard: y = mx + b, dove x rappresenta la concentrazione di μM e y è l'area del picco misurata dal campione sconosciuto.
NOTA: Un esempio della curva standard di calibrazione ADO è riportato in Figura 1, dove: x = (area y - 981.02)/40026
- Considerando che 2 x 106 cellule sono state risospese in 0,500 ml di terreno, calcolare i μmoli di AMP, ADO e INO consumati e/o prodotti da 106 cellule di LLC applicando la seguente proporzione:
μmoli : 1.000 ml = x μmoli : 0,250 ml
nota: I μmoli in 1.000 ml (numero μmoli in 1 L) di sono equivalenti alla concentrazione di μM e x sono i μmoli di nucleotide o nucleosidi prodotti da 106 cellule. Infine, convertire i μmoli in nmoli consumati e/o prodotti da 106 cellule LLC: nmoli = μmoli x 1.000
