Isolamento delle cellule T-ALL marcate in fluorescenza: un metodo per isolare le cellule T-ALL da zebrafish adulti

Abstract

Fonte: Pruitt, M. M., et al. Isolamento della popolazione laterale nella leucemia linfoblastica acuta a cellule T indotta da Myc nel pesce zebra. J. Vis. Exp. (2017).

Questo protocollo descrive la tecnica di isolamento delle cellule tumorali della leucemia linfoblastica acuta (T-ALL) marcate con fluorescenza da un pesce zebra adulto e di quantificazione utilizzando il colorante blu di tripano.

Protocollo

1. Raccolta di cellule T-ALL marcate in fluorescenza dal pesce tumorale primario

1. Preparare almeno 20 ml di siero fetale bovino inattivato termicamente al 10% in soluzione salina tamponata con fosfato 0,9x (FBS/PBS).
2. Aggiungere 1 mL di FBS/PBS a una fiala di sale sodico di eparina (300 unità).
3. Seleziona i pesci portatori di tumori in più del 50% del corpo o quei pesci che hanno difficoltà a mangiare o nuotare. Sacrificare i pesci sovradosandoli con tricaina o con immersione in acqua ghiacciata. Confermare la morte per mancanza di movimento branchiale e battito cardiaco.
4. Usa una lama di rasoio per rimuovere la testa del pesce.
5. Lavare la cavità del pesce con la soluzione di eparina per rimuovere i globuli rossi in eccesso.
   1. Utilizzando una pipetta, iniettare 100 μL di soluzione di eparina (aggiungere 1 mL di FBS/PBS a una fiala di sale sodico di eparina) nella cavità corporea del pesce. Rimuovere tutto il liquido che fuoriesce (conterrà cellule del sangue) e pipettarlo in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml.
   2. Utilizzare un puntale di pipetta nuovo per lavare nuovamente il corpo. Eseguire almeno tre lavaggi, o fino a quando il liquido che fuoriesce appare privo di sangue.
   3. Eliminare tutto il liquido dai lavaggi in questi passaggi, poiché non verrà utilizzato in ulteriori analisi.
6. Raccogli le cellule leucemiche.
   1. Iniettare 100 μL di FBS/PBS nella cavità corporea del pesce.
   2. Applicare una leggera pressione all'esterno del corpo del pesce con la punta della pipetta per spremere/spingere fuori le cellule tumorali.
      nota: Se questo passaggio viene eseguito utilizzando un microscopio da dissezione, le cellule tumorali che fuoriescono dalla cavità corporea saranno evidenti.
   3. Raccogliere il liquido e le cellule di ogni lavaggio in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
   4. Ripetere i passaggi 1.6.1-1.6.3 fino a quando la maggior parte delle cellule tumorali non viene raccolta (di solito 5-10 volte). Raccogliere tutte le cellule tumorali nella stessa provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. Mantenere le celle a temperatura ambiente.
7. Mescolare le cellule tumorali raccolte dal passaggio precedente pipettandole delicatamente per dissociare i grumi di cellule. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a rete da 40 μm. Lavare il filtro 1-2 volte con 100 μL di FBS/PBS. Mantenere le celle a temperatura ambiente.
8. Miscelare 2 μl di sospensione cellulare con 18 μl di blu di tripano (0,4%, diluito 1:10 e filtrato) in una nuova provetta. Caricare 10 μl su un emocitometro e contare il numero di cellule fluorescenti vive (non blu) per calcolare il numero di cellule tumorali isolate.
   nota: Le cellule GFP-negative non blu sono probabilmente cellule T normali e non maligne e non devono essere contate. Sono necessarie almeno 2 x 10⁶ celle per colorare le celle con Hoechst 33342.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pesce zebra singeneico (CG2)			Vedi Mizgireuv et al., 2006
rag2: plasmide c-myc			Laboratorio Langenau
rag2: plasmide GFP costruito nel laboratorio de Jong			promotore rag2 del Laboratorio Langenau
plasmide pCS2-trasposasi			Laboratorio Chien
Microscopio SteREO Discovery V8	Microscopia Carl Zeiss	Numero 495015-0008-000
Tricaina metanosulfonato (MS-222)	Chimica occidentale, Inc	Fisher Scientific - NC0342409	100 g
Siero fetale bovino (FBS)	Laboratori HyClone, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 ml
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco di Life Technologies	Codice 1001-023	pH 7,4 (1x) - 500 mL
Sale sodico di eparina	Sigma-Aldrich	Codice: 2106	15 - Fiale da 300 unità
Filtro a rete da 40 μm	Marchio Falcon Corning	Codice 352340	Cassa da 50
Tripan blu	Sigma Scienze della Vita	T8154	20 mL - Soluzione (0,4%)