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1. Colorazione delle cellule T-ALL marcate in fluorescenza con Hoechst 33342 per identificare la popolazione laterale
- Diluire Hoechst 33342 1:10 con H2O privo di nucleasi per ottenere la concentrazione di lavoro di 1 mg/mL. Conservare il colorante a 4 °C e al buio.
- Preparare una soluzione da 100 mM di verapamil sciogliendo 49,1 mg in 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO).
nota: Verapamil è un inibitore dei trasportatori ABC ed è un controllo importante per gli esperimenti di popolazione laterale. L'aggiunta di verapamil ai campioni inibirà la capacità dei trasportatori ABC di effondere il colorante Hoechst 33342. Pertanto, una vera popolazione laterale scomparirà quando il verapamil viene aggiunto al campione.
- Impostare un bagnomaria a 28 °C.
- Prepara campioni e controlli al buio aggiungendo cellule e soluzioni alle provette del selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS).
- Preparare i campioni aggiungendo 106 cellule, 15 μL di 1 mg/mL di Hoechst 33342 e 2,5 μL di DMSO a una provetta FACS. Regolare il volume a 1 mL con FBS/PBS.
- Preparare i controlli aggiungendo 106 cellule, 15 μL di 1 mg/mL di Hoechst 33342 e 2,5 μL di 100 mM di verapamil a una provetta FACS. Regolare il volume a 1 mL con FBS/PBS.
nota: Si raccomanda un minimo di10-6 cellule/campione, ma è preferibile colorare più cellule, soprattutto se le cellule della popolazione laterale verranno ordinate per ulteriori analisi. Non superare le10-6 cellule/mL e mantenere la concentrazione di Hoechst 33342 a 15 μg/mL. Se vengono colorate 10 x 106 cellule, il volume totale di reazione è di 10 ml.
- Incubare a bagnomaria a 28 °C al buio per 120 min.
- Dopo l'incubazione, posizionare immediatamente le cellule sul ghiaccio e tenerle al buio.
- Pellettare le celle a 4 °C per 6 minuti a 300 x g. Rimuovere il surnatante. Lavare con 1 mL di FBS/PBS.
- Pellettare le celle a 4 °C per 6 minuti a 300 x g. Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di FBS/PBS.
- Conservare a 4 °C fino alla selezione delle cellule.
- 15 minuti prima della selezione cellulare, aggiungere 2 μL di stock di ioduro di propidio (PI) (1 mg/mL) a ogni 1 mL di FBS/PBS (concentrazione finale: 2 μg/mL). Mescola bene.
2. Usa FACS per trovare la popolazione laterale all'interno della popolazione di cellule T-ALL marcate in fluorescenza
- Analizzare le sospensioni cellulari T-ALL di zebrafish colorate su una selezionatrice cellulare dotata di un laser UV per l'eccitazione del colorante Hoechst 33342 e di un laser a 488 nm per l'eccitazione PI e per il rilevamento delle cellule T-ALL GFP+.