1. Coltura di organoidi e preparazioni prima dell'elettroporazione
- Stabilire gli organoidi mediante digestione tissutale come descritto in precedenza ed espanderli con il loro corrispondente terreno di coltura specifico per entità in una panoramica della matrice basamentale vedi Tabella 1 e Tabella dei materiali
nota: Per i campioni di tessuto umano è necessario il consenso informato e l'approvazione dello studio da parte di un comitato etico.
- Preriscaldare le piastre a 48 pozzetti a 37 °C per la semina post-elettroporazione.
- Preparare il terreno basale senza antibiotici e il terreno di coltura di organoidi entità specifica senza antibiotici (vedere la Tabella 1), inclusi 10 μM di Y-27632 e 3 μM di CHIR99021,
nota: La sospensione degli antibiotici è importante per ridurre gli effetti tossici. Y-27632 e CHIR99021 migliorare il recupero cellulare.
- Preparazione degli organoidi (vedi Figura 1)
- Coltivare 5 pozzetti di organoidi in una piastra da 48 pozzetti per campione di elettroporazione in terreno di coltura.
nota: Devono essere utilizzati organoidi proliferativi (circa 2-3 giorni dopo l'ultima scissione).
- Preparare 230 μL di reagente di dissociazione (vedere la Tabella dei materiali) di cui 10 μM di Y-27632 per pozzetto.
- Estrarre il terreno di coltura da ciascun pozzetto e dissociare meccanicamente gli organoidi in 230 μl della miscela di dissociazione preparata. Raggruppare 5 pozzetti per campione di elettroporazione in una provetta da 15 mL.
- Mescolare a vortice e incubare per 5-15 minuti a 37 °C fino a quando non si formano gruppi di 10-15 cellule. Pertanto, controllare la dissociazione al microscopio. Arrestare la digestione aggiungendo terreno basale senza antibiotici fino a 10 mL.
nota: Questo passaggio è molto critico! L'efficienza dell'elettroporazione sarà ridotta, quando l'incubazione è troppo breve, ma una digestione lunga ridurrà la sopravvivenza.
- Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante e lavare due volte con 4 mL di tampone per elettroporazione (vedere la Tabella dei materiali).
2. Elettroporazione
NOTA: Il seguente protocollo è stato sviluppato per elettroporatori in grado di eseguire onde quadre e sequenze di impulsi di poring e trasferimento separati (vedi Figura 2). Opzionalmente, i valori di impedenza, nonché le tensioni, le correnti e le energie trasferite nel campione possono essere misurati come controllo per esperimenti riproducibili.
- Risospendere il pellet dell'organoide in 100 μL di tampone di elettroporazione (vedi Tabella dei materiali) contenente 30 μg di DNA plasmidico.
nota: La concentrazione del DNA plasmidico utilizzato deve superare i 5 μg/μL per una concentrazione ottimale di sale durante il processo di elettroporazione. Pertanto, si consigliano maxi kit di plasmidi endoliberi (vedi Tabella dei Materiali) per la preparazione dei vettori. Una quantità totale fino a 45 μg di DNA può essere utilizzata senza effetti citotossici.
- Erogare l'intera miscela DNA-organoide in una cuvetta per elettroporazione con una fessura di 2 mm senza produrre bolle d'aria.
- Impostare i parametri di elettroporazione (vedere Tabella 2, Figura 2).
- Mescolare leggermente le celle senza formare schiuma picchiettando la cuvetta con un dito. Posizionare la cuvetta nella camera della cuvetta.
- Premere il pulsante Ω dell'elettroporatore e prendere nota del valore di impedenza.
nota: Un'impedenza compresa tra 30-40 Ω ha mostrato i migliori risultati. In generale, dovrebbe essere compreso tra 30 e 55 Ω. In caso contrario, controllare i seguenti aspetti: larghezza della fessura della cuvetta utilizzata, collegamenti dei cavi dell'elettroporatore, eventuali bolle d'aria, volume corretto e concentrazione salina della miscela di elettroporazione.
- Premere il pulsante Start per eseguire il programma di elettroporazione e controllare i valori di correnti, tensioni ed energie visualizzate.
nota: I valori delle tensioni, delle correnti e delle energie misurate devono corrispondere ai parametri di elettroporazione impostati. Per il confronto di esperimenti ripetuti, può essere utile annotare questi dati.
- Dopo l'elettroporazione, aggiungere immediatamente 500 μl di terreno di coltura senza antibiotici (con CHIR99021 e Y-27632; vedere il passaggio 1.3). Miscelare pipettando su e giù per dissociare la schiuma bianca.
nota: La schiuma bianca appare dopo il processo di elettroporazione e ad essa è attaccato un numero significativo di cellule. Quindi, la dissociazione di esso è molto importante per non perdere le cellule.
- Trasferire completamente il campione dalla cuvetta in una nuova provetta da 15 mL utilizzando la pipetta appartenente alle cuvette di elettroporazione (vedere la Tabella dei materiali). Si consiglia di risciacquare nuovamente la cuvetta con terreno basale per ottenere le cellule rimanenti.
- Per la rigenerazione delle cellule, incubarle per 40 minuti a temperatura ambiente.
3. Semina delle cellule
- Centrifugare le celle a 450 x g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet in 100 μl di matrice basale e seminare 20 μl di gocce in una piastra preriscaldata a 48 pozzetti (vedere il passaggio 1.2). Incubare per 10 minuti a 37 °C per la polimerizzazione e aggiungere 250 μL di terreno di coltura, che viene integrato con Y-27632 e CHIR99021 fino alla successiva scissione degli organoidi cresciuti (circa 5-7 giorni).
4. Determinazione dell'efficienza di trasfezione
NOTA: In generale, si consiglia di elettroporare un vettore che trasporta un marcatore di fluorescenza come controllo di trasfezione aggiuntivo. A seconda del marcatore scelto e della sua maturazione cromoforica, la fluorescenza sarà visibile entro circa 24-48 ore dopo la trasfezione18.
- Controllare la fluorescenza al microscopio dopo 24-48 ore nel controllo della trasfezione (Figura 3B)
Tabella 1: Composizione dei terreni basali, miscele di digestione e terreni di coltivazione.
| Componenti del mezzo basale: | io | Ii |
| DMEM/F-12 avanzato | - | - |
| Glutamax | 1x | 1x |
| Hepes | 10 mM | 10 mM |
| Penicillina Streptomicina | - | 1x |
| Primocina | 1x | - |
| Stabilimento per digestione |
| Miscela di digestione: | Colon | Stomaco | Fegato | Pancreas |
| normale | tumorale | normale | tumorale | normale | tumorale | normale | tumorale |
| Collagenasi II | - | - | - | - | - | 0.625 mg/ml |
| Collagenasi XI | - | 0,1 mg/ml | - | 0,1 mg/ml | - | - |
| Collagenasi D | - | - | - | - | 2.5 mg/ml | - |
| Applicazione II | - | 1 mg/ml | - | 1 mg/ml | - | 2.5 mg/ml |
| DNasi I | - | - | - | - | 0.1 mg/ml | - |
| Edta | 2 milioni | - | 10 mM | - | - | - |
| Diluito in | Tampone chelante* | Media basale I | Tampone chelante* | Media basale I | in EBSS | Medio basale I |
| Incubazione per: | 0,5 h sul ghiaccio | 1h a 37°C | 0,25-0,5 h a RT | 1h a 37°C | 0,5-1 h a 37°C | 1,5 h a 37°C | 0,5-1 a 37°C | 2-3 h a 37°C |
| Adattato dal riferimento: | Sato et al. 2011 | Bartfeld et al. 2015 | Broutier et al. 2016 | Hennig et al. 2019 |
| Terreno di coltivazione (Base: Terreno basale II) |
| A83-01 | 0,5 μM | 2 μM | 5 μM | 0.5 μM |
| B27 | 1x | 1x | 1x | 1x |
| B27 senza Vitamina A | - | - | 1x | - |
| Forskolina | - | - | 10 μM | - |
| hFGF-10 | - | 200 ng/ml | 100 ng/ml | 100 ng/ml |
| hHGF | - | - | 25 ng/ml | - |
| [Leu15] Gastrin | 10 nM | 1 nM | 10 nM | 10 nM |
| mEGF | 50 ng/ml | 50 ng/ml | 50 ng/ml | 50 ng/ml |
| N2 | - | - | 1x | - | 1x |
| N-acetil-L-cisteina | 1,25 mM | 1 mM | 1 mM | 1 mM |
| Nicotinamide | 10 mM | 10 mM | 10 mM | 10 mM |
| zucca | 10 % | 10 % | - | 10 % |
| Primocina | 1x (100 μg/ml) | 1x (100 μg/ml) | 1x (100 μg/ml) | 1x (100 μg/ml) |
| Prostaglandina E2 | 10 nM | - | - | - | 1 μM |
| Rspondin | 20 % | 10 % | 10 % | 10 % |
| SB202190 | 3μM | - | - | - |
| Wnt3A | 50 % | 50 % | - | 50 % |
| *Tampone chelante: 5.6 mM Na2HPO4, 8.0 mM KH2PO4, 96.2 mM NaCl, 1.6 mM KCl, 43.4 mM saccarosio, 54.9 mM d-sorbitolo, 0.5 mM dl-ditiotreitolo in acqua distillata |
