Elettroporazione degli organoidi: un metodo per trasfettare il DNA plasmidico in organoidi gastrointestinali

Abstract

Fonte: Gaebler, A. M.et al.Protocollo di elettroporazione universale ed efficiente per l'ingegneria genetica di organoidi gastrointestinali. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video descrive il protocollo di elettroporazione per la trasfetzione di plasmidi di grandi dimensioni in organoidi gastrointestinali tridimensionali per dimostrare la sua funzionalità universale in diverse entità, vale a dire l'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), il cancro del colon-retto (CRC), il colangiocarcinoma (CCC) e il cancro gastrico (GC) organoidi.

Protocollo

1. Coltura di organoidi e preparazioni prima dell'elettroporazione

1. Stabilire gli organoidi mediante digestione tissutale come descritto in precedenza ed espanderli con il loro corrispondente terreno di coltura specifico per entità in una panoramica della matrice basamentale vedi Tabella 1 e Tabella dei materiali
   nota: Per i campioni di tessuto umano è necessario il consenso informato e l'approvazione dello studio da parte di un comitato etico.
2. Preriscaldare le piastre a 48 pozzetti a 37 °C per la semina post-elettroporazione.
3. Preparare il terreno basale senza antibiotici e il ter....

Risultati

Figura 1: Flusso di lavoro per la preparazione dell'elettroporazione. In primo luogo, gli organoidi dovrebbero essere dissociati in gruppi di 10-15 cellule e gli antibiotici dovrebbero essere lavati via. D.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
[Leu15] Gastrin	Sigma-Aldrich	G9145
A83-01	Tocris Bioscience	Codice: 2939
DMEM/F-12 avanzato	Invitrogen	12634010
B27	Invitrogen	17504044
Integratore di B27, meno vitamina A	Thermo Fisher Scientifico	12587010
CHIR99021	Stemgent	04-2004
Collagenasi II	Tecnologie per la vita	Codice 17101-015
Collagenasi XI	Sigma-Aldrich	C9407-100MG
Collagenasi D	Roche	11088866001
Applicazione II	Roche	4942078001
Dnase I	Sigma-Aldrich	D5319
D-sorbitolo	Roth	Codice 6213.1
Ditiotreitolo	Termo Scientifico	1859330
Edta	Roth	8040
Forskolina	Tocris Bioscience	Codice: 1099
Glutamax	Tecnologie per la vita	35050061
Hepes	Thermo Fisher Scientifico	15630106
hFGF-10	Preprotech	100-26
Kcl	Sigma-Aldrich	P9541
KH2PO4	Roth	3904.2
Matrigel	Corning	356231	matrice basale
mEGF	Invitrogen	PMG8043
N2	Invitrogen	17502048
NaCl	Roth	3957.1
Na2HPO4	Roth	K300.2
N-acetil-L-cisteina	Sigma-Aldrich	Codice: A9165
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
zucca	n.d.	n.d.	Terreno condizionato prodotto da celle HEK293 (Hek293- mNoggin-Fc)
HGF umano ricombinante	Preprotech	100-39 ore
Rspondin	n.d.	n.d.	Terreno condizionato prodotto da celle HEK293 (HA-Rspo1- Fc-293T)
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067
TrypLE Express	Gibco	12604021	Reagente di dissociazione
Wnt3A	n.d.	n.d.	Terreno condizionato prodotto da cellule L-Wnt3a (da Sylvia Boj)
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503
piastra a 48 pozzetti	Corning	Codice: 3548
Nepa Cuvette per elettroporazione con fessura di 2 mm con pipette	Fornitore verificato - Nepa Gene Co., Ltd.	EC-002S
Elettroporatore Nepa21	Fornitore verificato - Nepa Gene Co., Ltd.	n.d.
EVOS FL Auto	Invitrogen	AMAFD1000	Microscopio a fluorescenza
EndoFree Plasmide Maxi Ki	Qiagen	Codice 12362
Opti-MEM	Gibco	31985047	Tampone per elettroporazione
2 vettore concamero di gRNA	AddGene	Codice 84879
Plasmide PX458	AddGene	Numero 48138	codifica per sgRNA e Cas9
px458_Conc2 plasmide	AddGene	134449	Plasmide px458 contenente 2x promotori U6 per due diversi sgRNA