1. Digestione dei tumori del pancreas
- Posizionare il tumore pancreatico sezionato, i tumori metastatici o il tessuto pancreatico sano in PBS ghiacciato e conservare su ghiaccio.
- Usa una pinza per trasferire il tumore su una capsula di Petri.
- Aggiungere 5,0 mL di terreno di digestione (2 mg/mL di collagenasi, 0,025 mg/mL di DNasi RPMI) in una provetta da 50 mL; conservare in ghiaccio per prevenire l'inizio dell'attività enzimatica.
nota: Questo protocollo utilizza la collagenasi di tipo V, che ha un'attività di ≥1 unità/mg di FALGPA e > 125 unità di digestione del collagene (CDU)/mg solido. Le aliquote di collagenasi e DNasi possono essere conservate a -20 °C e scongelate con ghiaccio prima dell'uso. Quando entrambi sono completamente solubilizzati in RPMI sterile, possono essere fatti passare attraverso un filtro da 0,2 μm per rimuovere i contaminanti. La collagenasi deve essere completamente solubilizzata prima di essere filtrata per evitare la perdita di materiale.
- Prendi una piccola aliquota di questa soluzione per coprire il tumore sulla capsula di Petri.
- Usa bisturi e pinze sterili per tagliare il tumore in piccoli pezzi, lunghi all'incirca meno di 3 mm.
- Raschiare i pezzi di tumore nella provetta e capovolgere delicatamente la provetta fino a quando tutti i pezzi sono immersi nel mezzo di digestione. Conservare in ghiaccio se è necessario preparare altri campioni tumorali in un lotto.
- Trasferire su un dispositivo di agitazione per 20 minuti a 37 °C. Assicurarsi che tutti i pezzi di tumore siano immersi e non attaccati al bordo del tubo. Se l'agitazione non è possibile, agitare il campione ogni 5 minuti per facilitare la digestione.
2. Preparazione di una sospensione unicellulare da tumore digerito
- Immediatamente dopo la fase di digestione, posizionare il tubo sul ghiaccio per rallentare l'attività enzimatica.
- Aggiungere EDTA per ottenere una concentrazione finale di 20 mM e mescolare brevemente il campione a vortice. Ciò rallenterà ulteriormente l'attività enzimatica.
- Aprire la provetta e sciacquare il digestato del tumore dal coperchio della provetta con un nuovo mezzo RPMI.
- Preparare un colino da 70 μm (la dimensione in μm del colino può essere modificata a piacere) su una provetta aperta da 50 mL, su ghiaccio.
- Pre-bagnare il filtro con il fluido.
- Risospendere le cellule digerite e lavare i lati della provetta utilizzando una stripette da 25 ml o più grande. L'apertura più ampia della stripette è importante per consentire al digestato denso di passare facilmente.
- Trasferire tutto il digestato, utilizzando la stripette da 25 ml, sul colino.
- Schiacciare il tumore sopra il filtro usando uno stantuffo da siringa da 1 mL. Schiacciare solo direttamente su e giù per ridurre al minimo lo stress da taglio alle celle.
- Lavare continuamente le celle attraverso il filtro con RPMI. Assicurati di lavare con forza sufficiente per spingere le cellule.
- Se c'è ancora materiale da schiacciare, ma l'RPMI smette di fluire, il filtro sarà saturo. Pertanto, trasferire il campione in un nuovo filtro e continuare.
nota: Alla fine solo i componenti della matrice extracellulare rimarranno nel filtro, tutte le singole cellule dovrebbero essere passate.
- Centrifugare la provetta per 5 minuti a 300 x g e 4 °C.
- Risospendere con cautela il pellet cellulare in RPMI completo e passare direttamente attraverso un altro filtro per rimuovere eventuali matrici extracellulari o grandi grumi di cellule che non possono essere adeguatamente ririsospesi.
- A questo punto, se non è necessaria alcuna stimolazione, colorare immediatamente le cellule isolate per l'analisi di citometria a flusso saltando la centrifugazione della piastra per 5 minuti a 300 x g e 4 °C. Rimuovere il surnatante capovolgendo la piastra con un movimento brusco. In alternativa, risospenderli in mezzo di congelamento (10% di DMSO in FBS) e conservarli a -80 °C seguiti da una conservazione a lungo termine in azoto liquido.
nota: La fase di congelamento può consentire la purificazione delle cellule immunitarie in un secondo momento; Tuttavia, la quantificazione dei sottogruppi di cellule immunitarie può richiedere un'ottimizzazione per confermare che il numero di cellule e il fenotipo non siano influenzati dal processo di congelamento/scongelamento. La stimolazione ex vivo delle cellule T viene eseguita al meglio su campioni tumorali freschi. A questo punto, il campione può essere ulteriormente purificato mediante rimozione di cellule morte basate su microsfere o saggi di arricchimento delle cellule immunitarie, se necessario.
3. Preparazione delle cellule per la stimolazione ex vivo
- Contare le cellule per ottenere una concentrazione di 2 x 106/ 100 μL in terreno completo (RPMI 10 % FBS, 1X penicillina e 1X streptomicina).
nota: L'elevato numero di cellule totali piastrate garantisce che ci siano cellule T adeguate all'interno di questo campione da analizzare. Tuttavia, il numero può essere aumentato o diminuito a seconda della disponibilità del campione e della rarità dei sottogruppi di cellule T di interesse.
- Piastra 100 μL di cellule in una piastra a 96 pozzetti con fondo a U.
- Aggiungere 100 μl di terreno completo contenente una preparazione 2x di PMA/ionomicina (per ottenere una concentrazione finale di 0,081 μM e 1,34 μM, rispettivamente, come raccomandato dal produttore).
nota: Se si misura la degranulazione/esocitosi, includere qui anche un CD107a anti-topo coniugato fluorescente nel terreno. Deve essere eseguito anche un campione di controllo che non contiene CD107a.
- Mettere in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2 per 1 ora.
- Aggiungere 20 μl di una preparazione 10x di brefeldina A e monensina (per ottenere una concentrazione finale di 1,06 μM e 2,0 μM, rispettivamente (come raccomandato dal produttore) in un terreno completo.
nota: La brefeldina A e la monensina sono inibitori del trasporto delle proteine e quindi bloccano il rilascio extracellulare di citochine, ecc., permettendo la loro rilevazione mediante citometria a flusso. Se si misura il rilascio di citochine nel surnatante mediante ELISA o metodi simili, questo passaggio può essere saltato.
- Porre la piastra in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2 per altre 4 ore.
