Imaging della dinamica del calcio nelle cellule pancreatiche: una tecnica per studiare i cambiamenti in tempo reale nella concentrazione citosolica di calcio nelle isole pancreatiche

Abstract

Fonte: Hamilton, A., et. Imaging della dinamica del calcio in sottopopolazioni di cellule insulari pancreatiche di topo. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive la tecnica di imaging delle cellule insulari in tempo reale, per studiare i cambiamenti nella concentrazione citosolica di calcio nelle sottopopolazioni minori delle cellule delle isole pancreatiche. Le sottopopolazioni cellulari minori possono essere identificate utilizzando risposte funzionali a composti marcatori, come l'adrenalina e la grelina, che inducono cambiamenti nel calcio citosolico in specifiche popolazioni di cellule insulari. Questo può fornire un'idea del cross-talk tra la glicemia e l'output secretorio delle isole.

Protocollo

1. Carica il colorante o estrai il sensore

1. Preparare il colorante intrappolabile.
   1. Sciogliere l'aliquota (normalmente, 50 μg) del colorante intrappolabile (ad es. Fluo-4) in DMSO a una concentrazione stock di 2 mM. Aggiungere acido pluronico a una concentrazione finale dell'1% (utilizzando un 20% di stock in DMSO), per migliorare la solubilizzazione del colorante.
   2. Aliquotare il colorante in piccole provette per PCR (2 μl in ciascuna). Il colorante può essere conservato congelato (-20 °C) per diverse settimane.
2. In alternativa, preparare il sensore ricombinante.
   1. Distribuire il sensore (ad es. vettore adenovirale che codifica per GCaMP6f) in aliquote da 10 μL e conservare a -80 °C.
   2. (Facoltativamente) pre-testare il titolo dello stock virale infettando le isole (come di seguito) utilizzando diverse diluizioni seriali, per rivelare la concentrazione ottimale per l'infezione.
      nota: I sensori ricombinanti codificati da vettori diversi (lentivirus, BacMam, AAV) richiedono un protocollo di infezione diverso. Assicurati di verificarlo con il fornitore di vettori e ottimizza il rapporto di lavoro in base alle tue esigenze. Lo stock "di lavoro" dell'adenovirus può essere conservato a -20 °C e congelato/scongelato più volte. Un eccessivo ciclo di gelo-disgelo riduce il titolo effettivo del virus.
3. Preparare la soluzione di imaging.
   1. Preparare la soluzione di imaging, mM: 140 NaCl, 4,6 KCl, 2,6 CaCl₂, 1,2 MgCl₂, 1 NaH₂PO₄, 5 NaHCO₃, 10 HEPES (pH 7,4, con NaOH).
   2. Costituire una scorta di glucosio (0,5 M) e mannitolo (0,5 M) nella soluzione di imaging. Il brodo può essere conservato in frigorifero (4 °C) per diverse settimane.
4. Carica il colorante intrappolabile.
   1. Preparare la soluzione di lavoro del colorante sciogliendo 2 μl di colorante in 600 μl della soluzione di imaging contenente 6 mM di glucosio. La soluzione può essere riscaldata o vorticosa per migliorare la solubilizzazione.
   2. Caricare le isole isolate nella soluzione di lavoro del colorante. Il caricamento può essere effettuato utilizzando una piastra multipozzetto o una piastra di Petri. In quest'ultimo caso, posizionare una goccia da 100 μL della soluzione di lavoro sul fondo di una piastra di Petri non adesiva (35 o 60 mm) e pipettare 10-30 isole nella gocciolina.
   3. In caso di diversi gruppi di isolotti (ad es. wild-type/knock-out), predisporre più pozzetti e più goccioline in modo che il caricamento possa essere effettuato contemporaneamente.
   4. Incubare le isole nella soluzione di lavorazione del colorante a temperatura ambiente al buio per 70-90 minuti. Non incubare eccessivamente.
   5. Controllare il carico al microscopio a fluorescenza; le isole dovrebbero acquisire una leggera fluorescenza, con alcune cellule più luminose delle altre. L'arrotondamento delle cellule e la localizzazione nucleare del colorante sono segni di sovraccarico.
   6. Trasferire le isole in una soluzione di imaging priva di coloranti contenente 6 mM di glucosio. Le isole possono essere utilizzate immediatamente per l'imaging, ma opzionalmente il colorante può essere lasciato deesterificare per altri 10-15 minuti. Le isole trattengono il colorante per diverse ore e quindi possono essere utilizzate per l'imaging in diversi turni.
5. In alternativa, infettare le isole con il vettore ricombinante.
   1. Placcare le isole in goccioline nel terreno di coltura RPMI (RMPI1640 (vedi Tabella dei materiali), integrato con il 10% di siero fetale di vitello, 100 unità/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina. Erogare il terreno in due piastre di Petri di plastica da 60 mm (non trattate con alcun adesivo) e conservare le piastre nell'incubatore (37 °C, 5% CO₂, umidità assoluta)). (ad esempio, 30 μL), per ridurre al minimo il volume del vettore necessario.
   2. Aggiungere il vettore a un rapporto di circa 10⁵ unità infettive/isola che dovrebbe idealmente portare a una molteplicità di infezioni >2. Idealmente il rapporto dovrebbe essere ottimizzato al rapporto minimo che fornirebbe espressione nello strato periferico. La pre-titolazione (passaggio 1.2.2) può essere d'aiuto.
   3. Introdurre 20-50 isolotti nella gocciolina e coltivare per 8-48 ore. (Idealmente, durante la notte). Le isole dovrebbero sviluppare una debole fluorescenza verde nella maggior parte delle cellule, senza cambiamenti nella morfologia cellulare.
      nota: Il successo dell'infezione e l'espressione dipendono dal tempo di esposizione alla soluzione virale. Idealmente, il virus dovrebbe rimanere nella soluzione durante la notte, ma può essere rimosso opzionalmente dopo appena 15 minuti. Tuttavia, è probabile che l'infettività, e quindi l'espressione, sia drasticamente inferiore.

2. Imaging Ca²⁺ dinamica

1. Immobilizzare le isole al microscopio (invertito).
   1. Assemblare la camera di imaging per la microscopia invertita. Posizionare il vetrino coprioggetto (spessore 1 o 1,5) all'interno della camera e assicurarsi che l'interfaccia vetro-camera sia a tenuta stagna. Verificare che il vetrino coprioggetti sia a portata di mano dell'obiettivo del microscopio (fondamentale per il caso di un ingombrante obiettivo ad alto NA).
   2. Preparare gli accessori di immobilizzazione. Tagliare piccoli rettangoli (20 mm x 20 mm) dalla maglia fine e dalla maglia grossa. Introdurre due "pareti" distanziatrici sulla maglia fine utilizzando un nastro adesivo di 45-50 μm di spessore. Utilizzare doppi strati del distanziatore se la dimensione delle isole da fotografare supera sostanzialmente i 100 μm convenzionali.
   3. Immergere le maglie e il peso nella soluzione di imaging utilizzando una piastra di Petri da 35 mm. Assicurati che la plastica e il metallo siano bagnati.
   4. Sotto un microscopio da dissezione, capovolgere la maglia fine con le "pareti" del distanziatore, i distanziatori rivolti verso l'alto. Prelevare diverse isole caricate con il colorante intrappolabile o che esprimono il sensore ricombinante con una pipetta P20 e posizionarle delicatamente sopra la maglia fine, tra i due distanziatori. Assicurarsi che la rete e le rondelle non contengano quantità eccessive di soluzione di imaging su di esse.
   5. Raccogliere la rete con le isole, utilizzando una pinza da orologiaio, e posizionarla capovolta all'interno della camera di imaging, in modo che i distanziatori siano rivolti verso il basso e si trovino direttamente sul vetrino coprioggetti della camera. Assicurarsi che le isole siano intrappolate tra i distanziatori e la rete, al centro del vetrino coprioggetti.
   6. Posizionare la maglia grossa e il peso sopra la maglia fine all'interno della camera. Introdurre la soluzione di imaging nella camera. Assicurarsi che le isole siano immobilizzate e pronte per essere fotografate. Evitare di scuotere eccessivamente la camera (sono accettabili piccole perturbazioni come il trasporto della camera al microscopio e l'inserimento in un tavolino riscaldato).
      nota: Una disposizione di immobilizzazione simile può essere applicata per un sistema verticale.
2. Impostare il microscopio.
   1. Scegli la modalità di imaging e l'obiettivo, posiziona la camera con le isole dal passaggio 2.1 sul tavolino a temperatura controllata del microscopio.
      1. Impostare il controllo della temperatura (idealmente, tra 30 °C e 36 °C) e la perfusione. Per un sistema invertito, posizionare l'afflusso più in basso del deflusso all'interno della camera e impostare il flusso di deflusso in modo che sia maggiore di quello dell'afflusso (che in genere si ottiene utilizzando un tubo di diametro interno più ampio su una pompa peristaltica).
      2. Assicurarsi che il deflusso abbia una superficie di contatto minima con la soluzione, in modo da rimuovere la soluzione in più piccole goccioline sequenziali, evitando lunghi intervalli di rimozione continua della soluzione. Quest'ultimo è la principale fonte di artefatti nell'imaging time-lapse dei segnali periodici in quanto appaiono come oscillazioni periodiche regolari di intensità di ogni pixel ripreso e sono spesso interpretati come "onde lente".
      3. Iniziare la perfusione con la soluzione di imaging contenente 3 mM di glucosio.
   2. Scegliere il percorso della luce e i filtri per l'imaging dei fluorofori verdi; l'eccitazione tra 470 e 500 e l'emissione tra 505 e 550 funzionerebbero per ciascuno di essi.
   3. Eseguire l'imaging in tempo reale per impostare i parametri di imaging. Regola la vista per catturare gli isolotti di interesse.
   4. Ottimizza il rapporto segnale/rumore dell'immagine. A tal fine, regolare l'intensità della luce di eccitazione, il tempo di esposizione e il binning. Assicurarsi che le impostazioni consentano una visualizzazione distinta di ogni cella all'interno dell'isolotto con la minima intensità ed esposizione alla luce possibile.
   5. Eseguire l'acquisizione delle immagini. A seconda dell'attività, le immagini possono essere scattate a una velocità compresa tra 0,1 e 5 Hz. Questo è ben al di sotto dei criteri di Nyquist per le oscillazioni veloci guidate da Na⁺ in celle α e δ (>300 Hz), il che significa che i dati sono sottocampionati per impostazione predefinita. Tuttavia, l'aumento della frequenza di acquisizione per soddisfare questa domanda non è fattibile nell'imaging multicellulare/multi-isola con un ampio campo visivo. GCaMP può essere riprodotto più velocemente, mentre Fluo4 sbianca inevitabilmente in condizioni di acquisizione rapida.
      nota: Dato che le oscillazioni [Ca²⁺]_cyt nelle cellule insulari sono guidate dall'attività elettrica, l'uso di bassi tassi di acquisizione può sembrare controproducente. In realtà, tuttavia, velocità di acquisizione intorno o superiori a 1 Hz possono essere sufficienti per risolvere il comportamento di spiking delle celle β, mentre la soglia per il rilevamento delle oscillazioni guidate dal canale del sodio nelle celle a α e δ è ben al di sopra di 300 Hz. Indipendentemente dal fatto che le oscillazioni di α o δ cellule [Ca²⁺]_cyt siano acquisite a 1 Hz o 0,1 Hz, saranno gravemente sottocampionate e rifletteranno la manipolazione di Ca²⁺ da parte della cellula piuttosto che l'attività elettrica.
      1. Verificare la qualità dei dati acquisiti: a 3 mM di glucosio, l'attività delle cellule α dovrebbe essere chiaramente visibile/rilevabile. Assicurati che questo sia il caso e procedi con l'imaging time-lapse su larga scala.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Obiettivo 40x/1,3
GCaMP6f, nel vettore adenovirale (umano di tipo 5)	Vector Biolabs	1910
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
RPMI medio	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
penicillina/streptomicina	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
Microscopio Axiovert 200
Fluo4	Thermo Fisher (Life Technologies)	F14201