Isolamento primario delle cellule acinose: un metodo per isolare le cellule acinose dal pancreas di topo

Abstract

Fonte: Fleming Martinez, A. K., et al. Imitazione e manipolazione della metaplasia pancreatica acina-duttale in colture cellulari tridimensionali. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive la tecnica utilizzata per isolare le cellule acinose pancreatiche - cellule esocrine - contenenti una varietà di enzimi digestivi. Le cellule acinose primarie sono utili nello studio ex vivo della metaplasia acino-duttale (ADM), un evento precoce nello sviluppo del cancro al pancreas.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di jove.

1. Isolamento delle cellule acinose

1. Sacrificare il topo tramite induzione di CO ₂ ed eseguire la lussazione cervicale. Sezionare immediatamente il pancreas. Per sezionare il pancreas, prima appuntare le zampe del topo al coperchio di polistirolo, orientare il topo in modo che la coda sia rivolta verso il ricercatore e spruzzare l'addome con > nota: Il topo utilizzato nei risultati rappresentativi era una femmina non transgenica di 12 settimane con background C57BL/6. La selezione del mouse è ulteriormente discussa nella sezione di discussione.
   1. Utilizzando un set di forbici e pinze autoclavate, sollevare il pelo/pelle con la pinza sulla linea mediana e utilizzare le forbici per praticare un'incisione attraverso il pelo e la pelle dall'apertura uretrale all'area del diaframma/gabbia toracica.
   2. Praticare ulteriori incisioni a sinistra e a destra in modo tale che il pelo/pelle venga tagliato via per creare una visione chiara della cavità addominale. Quindi, tagliare la fodera peritoneale (al centro, a destra e a sinistra) e allontanarla dagli organi, come è stato fatto con la pelliccia/pelle.
   3. Solleva l'intestino con la pinza e mettilo sul lato sinistro del topo creando spazio per vedere il pancreas, che è di colore rosa chiaro, e attaccato alla milza, che è un ovale rosso scuro. Il tessuto pancreatico si distingue per la sua consistenza morbida e spugnosa. Tagliate il pancreas che correrà lungo lo stomaco e si intreccerà con l'intestino.
   4. Separare la milza dal pancreas. Quindi, mettere il pancreas in una provetta da 50 ml contenente 10 ml di HBSS con 1x penicillina-streptomicina e portarlo nella cappa a flusso laminare.
      nota: Le restanti fasi del protocollo devono essere eseguite utilizzando una tecnica sterile in una cappa a flusso laminare.
2. Versare il pancreas e l'HBSS (con penicillina-streptomicina) in una bilancia vuota e, usando una pinza, lavare il pancreas facendolo roteare. Quindi, spostare il pancreas con la pinza su una seconda bilancia contenente HBSS (con penicillina-streptomicina). Anche in questo caso, lavare il pancreas roteando.
3. Spostare il pancreas sulla terza pesa HBSS (con penicillina-streptomicina) e iniziare a tagliare il pancreas in piccoli pezzi di 5 mm o meno. Quindi, versare i pezzi di pancreas e l'HBSS in una provetta vuota da 50 ml.
   1. Per fare ciò, utilizzare le pinze per spostare i pezzi di pancreas nel liquido mentre la barca della pesa viene ribaltata. Versare una volta che tutti i pezzi non sono più attaccati alla pesa. Raccogliere eventuali pezzi rimanenti con la pinza e lavare la pinza nella provetta da 50 ml contenente il pancreas in HBSS con penicillina-streptomicina.
4. Centrifugare a 931 x g per 2 minuti a 4 °C, quindi rimuovere l'HBSS (e l'eventuale grasso che galleggia) pipettandolo con una pipetta da 5 ml.
5. Aggiungere 5 ml di collagenasi (Preparare 40 ml di HBSS + 5% FBS, 20 ml di HBSS + 30% FBS e 5 ml di 2 mg/mL di collagenasi in HBSS. Sterilizzare la collagenasi mediante filtrazione (poro 0,22 μm) e conservare a temperatura ambiente. Tenere ciascuna delle soluzioni HBSS in ghiaccio) al pancreas. Assicurarsi che il coperchio sia sigillato avvolgendo la provetta da 50 ml in una pellicola di plastica e quindi posizionarla in un'incubatrice agitando a 220 giri/min per 20 minuti a 37 °C.
   nota: Il tempo di digestione della collagenasi può variare, come notato nella discussione. Alla fine dell'incubazione, non dovrebbero rimanere grandi pezzi di tessuto.
6. Per fermare la dissociazione, posizionare la provetta contenente il pancreas sul ghiaccio e aggiungere 5 ml di HBSS freddo + 5% FBS. Centrifugare a 931 x g per 2 minuti a 4 °C e quindi pipettare il surnatante utilizzando una pipetta da 5 mL.
7. Risospendere in 10 mL di HBSS + 5% FBS e centrifugare a 931 x g per 2 minuti a 4 °C. Pipett dal surnatante utilizzando una pipetta da 5 mL e ripetere questo passaggio con altri 10 mL di HBSS + 5% FBS.
8. Risospendere in 5 mL di HBSS + 5% FBS e, utilizzando un P1000, trasferire 1 mL alla volta attraverso una rete da 500 μm in una provetta da 50 mL. Aggiungere altri 5 ml di HBSS + 5% FBS attraverso la rete con un P1000 per lavare le cellule pancreatiche rimanenti attraverso la rete.
9. Inserire la sospensione cellulare dalla rete da 500 μm attraverso la rete da 105 μm pipettando 1 mL alla volta utilizzando un P1000. Quindi, pipettare delicatamente la sospensione cellulare in una provetta contenente HBSS + 30% FBS. Nella parte superiore si formerà uno strato di sospensione cellulare; Dopo la centrifugazione, le cellule acinose affonderanno per formare un pellet.
10. Centrifugare a 233 x g per 2 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1x il terreno completo di Waymouth.
    1. Se si procede direttamente all'incorporazione di cellule nella matrice di collagene o di membrana basale, risospendere in un volume di 7 mL per pancreas. Se si procede a un'infezione adenovirale o lentivirale, risospendere in 4 ml per pancreas.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Incubatore ad agitazione 37 °C	Termo Scientifico	SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubatore	NUAIRE	NU-5500
Tubi da 50 ml	Falcone	Codice 352070
Tampone assorbente, 20" x 24"	Fisherbrand	1420662
Ago di scorrimento di precisione BD 21G x 1/2	Fisher Scientifico	305167	Utilizzo come perni per la dissezione
Becher, 600 mL	Fisherbrand	FB-101-600
centrifuga	Beckman Coulter	Allegra X-15R Centrifuga
Collagenasi di tipo I, Clostridium histolyticum	sigma	C0130-1G	Creare una soluzione da 100 mg/ml sciogliendo la polvere in acqua sterile di biologia molecolare. Quando si scongela un'aliquota, diluire a 10 mg/ml, sterilizzare con filtro e porre 1 ml di aliquote a -20 °C.
desametasone	sigma	D1756	Creare una soluzione di 4 mg/ml sciogliendo la polvere in metanolo, aliquotandola e conservandola a -20 °C.
Etanolo, 200 proof	Laboratori Decon	Codice: 2701
Siero fetale bovino	sigma	F0926-100mL
forcipe	Strumenti per la scienza	Codice 11002-12
forcipe	Strumenti per la scienza	Codice 91127-12
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo	Fisher Scientifico	SH3048801
Secchiello per il ghiaccio, rettangolare	Fisher Scientifico	07-210-103
Sacche per campioni LAB GUARD (per topi dopo dissezione)	Minigrip	SBL2X69S
Parafilm	Bemis	PM992	Indicato come "pellicola di paraffina di plastica" nel manoscritto
Pbs	Fisher Scientifico	SH30028.02
Penicillina-Streptomicina	ThermoFisher Scientifico	15140122
Punte per pipette, 10 μl	Stati Uniti d'America Scientific	1110-3700
Punte per pipette, 1000 μl	Olympus Plastics	24-165RL
Punte per pipette, 200 μl	Stati Uniti d'America Scientific	Codice: 1111-1700
Pipet-Aid	Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl	Gilson	F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl	Gilson	F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl	Gilson	F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl	Gilson	F123601
Pipette, 10 ml	Falcone	357551
Pipette, 25 ml	Falcone	357525
Pipette, 5 ml	Falcone	357543
Rete in polipropilene, 105 μm	Laboratori dello spettro	146436
Rete in polipropilene, 500 μm	Laboratori dello spettro	146418
forbici	Strumenti per la scienza	Codice: 14568-12
forbici	Strumenti per la scienza	Codice: 14568-13
Bicarbonato di sodio (polvere bianca fine)	Fisher Scientifico	BP328-500
idrossido di sodio	Fisher Scientifico	S318-500
Inibitore della tripsina della soia	Gibco	17075029
spatola	Fisherbrand	Codice 21-401-10
Filtri Steriflip da 50 ml, 0,22 micron	Millipore	SCGP00525
Collagene di coda di ratto di tipo I	Corning	354236
Waymouth MB 752/1 Medium (polvere)	sigma	W1625-10X1L
Pesa barca, esagonale, media	Fisherbrand	02-202-101