Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di materiali, soluzioni e basi di matrici tridimensionali
- Tagliare reti in polipropilene da 500 μm e 105 μm in quadrati da 76 mm per 76 mm. Piega ogni quadrato a metà due volte per creare un quadrato piegato più piccolo. Inserire un quadrato a maglie da 500 μm e uno da 105 μm in una busta autoclavabile.
- Squadre in rete di polipropilene per autoclave, oltre a due paia di forbici e pinze.
- Prepara 100 ml di soluzione 10x Waymouth. Mescolare 1 flaconcino (14 g) di polvere di Waymouth in 50 ml di acqua deionizzata (DI) e, una volta sciolto, aggiungere 30 ml di bicarbonato di sodio al 7,5% (75 g/L). Portare il volume finale a 100 ml utilizzando acqua deionizzata e sterilizzare con filtro.
- Conservare 10 terreni Waymouth a 4 °C e utilizzarli per preparare gel di collagene e 1 terreno Waymouth. Quando si formano i precipitati, scartare.
- Preparare 50 ml di 1x terreno completo di Waymouth per pancreas aggiungendo 125 μL di inibitore della tripsina di soia da 40 mg/mL, 12,5 μL di desametasone da 4 mg/mL e 500 μL di siero fetale bovino (FBS). Sterilizzare per filtrazione e utilizzare entro 48 ore.
- Preparare le basi della matrice tridimensionale utilizzando il collagene o la matrice della membrana basale (vedere la Tabella dei materiali per informazioni sul prodotto). Quando si pipetta la base, posizionare la piastra sul ghiaccio, evitare la formazione di bolle e ruotare la piastra subito dopo aver pipettato il volume di ciascun pozzetto per garantire una copertura completa.
- Creare basi di collagene mescolando i seguenti componenti su ghiaccio in una cappa di coltura tissutale: 5,5 ml di collagene di coda di ratto di tipo I, 550 μl di 10x Waymouth's Media e 366,6 μl di 0,34 M NaOH (filtrato).
NOTA: Questa è una soluzione sufficiente per creare basi di collagene per una piastra a 24 pozzetti, 12 pozzetti o 6 pozzetti. Una piastra è sufficiente per l'isolamento acinose da un pancreas.
- Utilizzare i seguenti volumi per piastrare la base di collagene: 80 μl (vetrino da 8 pozzetti), 200 μl (piastra da 24 pozzetti), 400 μl (piastra da 12 pozzetti) o 800 μl (piastra da 6 pozzetti).
- Per le basi della matrice a membrana basale, pipettare la matrice senza componenti aggiuntivi. Utilizzare i seguenti volumi per ogni pozzetto: 50 μl (vetrino a 8 pozzetti), 120 μl (piastra a 24 pozzetti), 240 μl (piastra a 12 pozzetti) o 600 μl (piastra a 6 pozzetti).
- Lasciare solidificare le basi per almeno 30 minuti in un incubatore per colture cellulari (37 °C, 5% CO2) prima di creare un secondo strato di matrice con cellule incorporate sopra queste basi.
- In preparazione all'isolamento acinose, tenere un becher da 600 mL, tre provette da 50 mL, un paio di forbici autoclavate, un paio di pinze autoclavate e un secchiello per il ghiaccio sotto il cofano con tre barchette di pesatura. Quindi, preparare 30 mL di HBSS con 300 μL di 100x penicillina-streptomicina, inserendo 10 mL in ciascuna delle due pese e mantenendo gli ultimi 10 mL in una provetta da 50 mL (da utilizzare nei passaggi 1.8.2 e 2.1.4).
- Preparare 40 ml di HBSS + 5% FBS, 20 ml di HBSS + 30% FBS e 5 ml di 2 mg/mL di collagenasi in HBSS. Sterilizzare la collagenasi mediante filtrazione (poro 0,22 μm) e conservare a temperatura ambiente. Mantieni ciascuna delle soluzioni HBSS sul ghiaccio.
- Assemblare uno spazio di lavoro per la dissezione del pancreas, che può essere eseguita su un banco da laboratorio.
- Metti un tampone assorbente sul tavolo, insieme a un coperchio di polistirolo ricoperto di carta stagnola. Quindi posizionare un tovagliolo di carta con 4 spilli sopra la pellicola.
- Tenere a portata di mano l'area di dissezione dei seguenti oggetti: una sacca per l'incenerimento, un set di forbici e pinze autoclavate, un flacone spray con etanolo al 70% e un secchiello per il ghiaccio (con la provetta da 50 ml di HBSS contenente penicillina-streptomicina del passaggio 1.6).
- Impostare una centrifuga a 4 °C e un agitatore a 37 °C.
2. Isolamento delle cellule acinose
- Sacrificare il topo tramite induzione di CO2 ed eseguire la lussazione cervicale. Sezionare immediatamente il pancreas. Per sezionare il pancreas, prima appuntare le zampe del topo al coperchio di polistirolo, orientare il topo in modo che la coda sia rivolta verso il ricercatore e spruzzare l'addome con etano> Il topo utilizzato nei risultati rappresentativi era una femmina non transgenica di 12 settimane con background C57BL/6. La selezione del mouse è ulteriormente discussa nella sezione di discussione.
- Utilizzando un set di forbici e pinze autoclavate, sollevare il pelo/pelle con la pinza sulla linea mediana e utilizzare le forbici per praticare un'incisione attraverso il pelo e la pelle dall'apertura uretrale all'area del diaframma/gabbia toracica.
- Praticare ulteriori incisioni a sinistra e a destra in modo tale che il pelo/pelle venga tagliato via per creare una visione chiara della cavità addominale. Quindi, tagliare la fodera peritoneale (al centro, a destra e a sinistra) e allontanarla dagli organi, come è stato fatto con la pelliccia/pelle.
- Solleva l'intestino con la pinza e mettilo sul lato sinistro del topo creando spazio per vedere il pancreas, che è di colore rosa chiaro, e attaccato alla milza, che è un ovale rosso scuro. Il tessuto pancreatico si distingue per la sua consistenza morbida e spugnosa. Tagliate il pancreas che correrà lungo lo stomaco e si intreccerà con l'intestino.
- Separare la milza dal pancreas. Quindi, mettere il pancreas in una provetta da 50 ml contenente 10 ml di HBSS con 1x penicillina-streptomicina e portarlo nella cappa a flusso laminare.
nota: Le restanti fasi del protocollo devono essere eseguite utilizzando una tecnica sterile in una cappa a flusso laminare.
- Versare il pancreas e l'HBSS (con penicillina-streptomicina) in una bilancia vuota e, usando una pinza, lavare il pancreas facendolo roteare. Quindi, spostare il pancreas con la pinza su una seconda bilancia contenente HBSS (con penicillina-streptomicina). Anche in questo caso, lavare il pancreas roteando.
- Spostare il pancreas sulla terza pesa HBSS (con penicillina-streptomicina) e iniziare a tagliare il pancreas in piccoli pezzi di 5 mm o meno. Quindi, versare i pezzi di pancreas e l'HBSS in una provetta vuota da 50 ml.
- Per fare ciò, utilizzare le pinze per spostare i pezzi di pancreas nel liquido mentre la barca della pesa viene ribaltata. Versare una volta che tutti i pezzi non sono più attaccati alla pesa. Raccogliere eventuali pezzi rimanenti con la pinza e lavare la pinza nella provetta da 50 ml contenente il pancreas in HBSS con penicillina-streptomicina.
- Centrifugare a 931 x g per 2 minuti a 4 °C, quindi rimuovere l'HBSS (e l'eventuale grasso che galleggia) pipettandolo con una pipetta da 5 ml.
- Aggiungere 5 mL di collagenasi (diluita in HBSS al passaggio 1.7) al pancreas. Assicurarsi che il coperchio sia sigillato avvolgendo la provetta da 50 ml in una pellicola di plastica e quindi posizionarla in un'incubatrice agitando a 220 giri/min per 20 minuti a 37 °C.
NOTA: Il tempo di digestione della collagenasi può variare, come indicato nella discussione. Alla fine dell'incubazione, non dovrebbero rimanere grandi pezzi di tessuto.
- Per fermare la dissociazione, posizionare la provetta contenente il pancreas sul ghiaccio e aggiungere 5 ml di HBSS freddo + 5% FBS. Centrifugare a 931 x g per 2 minuti a 4 °C e quindi pipettare il surnatante utilizzando una pipetta da 5 mL.
- Risospendere in 10 mL di HBSS + 5% FBS e centrifugare a 931 x g per 2 minuti a 4 °C. Pipett dal surnatante utilizzando una pipetta da 5 mL e ripetere questo passaggio con altri 10 mL di HBSS + 5% FBS.
- Risospendere in 5 mL di HBSS + 5% FBS e, utilizzando un P1000, trasferire 1 mL alla volta attraverso una rete da 500 μm in una provetta da 50 mL. Aggiungere altri 5 ml di HBSS + 5% FBS attraverso la rete con un P1000 per lavare le cellule pancreatiche rimanenti attraverso la rete.
- Inserire la sospensione cellulare dalla rete da 500 μm attraverso la rete da 105 μm pipettando 1 mL alla volta utilizzando un P1000. Quindi, pipettare delicatamente la sospensione cellulare in una provetta contenente HBSS + 30% FBS. Nella parte superiore si formerà uno strato di sospensione cellulare; Dopo la centrifugazione, le cellule acinose affonderanno per formare un pellet.
- Centrifugare a 233 x g per 2 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1x il terreno completo di Waymouth.
- Se si procede direttamente all'incorporazione di cellule nella matrice di collagene o di membrana basale, risospendere in un volume di 7 mL per pancreas. Se si procede a un'infezione adenovirale o lentivirale, risospendere in 4 ml per pancreas.
3. Infezione virale
- Poiché un pancreas è sufficiente per due infezioni virali (di controllo e sperimentali, ad es. null e cre), dividere la sospensione cellulare tra i coperchi di due piastre da 35 mm. L'uso del coperchio delle piastre consente l'infezione in sospensione e quindi un facile spostamento sul substrato finale in un secondo momento.
- Quando si lavora con il virus, immergere tutti i puntali delle pipette usati in candeggina al 10% per almeno 15 minuti.
nota: L'utilizzo delle piastre da 35 mm e del volume di 4 mL funziona bene per le cellule di topi non transgenici di età compresa tra 8 e 16 settimane. Potrebbe essere necessario regolare le dimensioni e il volume della piastra per gli animali con pancreas più piccolo o più grande.
- Per l'infezione adenovirale, aggiungere il virus (con un titolo di almeno10-7 TU/mL) a una diluizione 1:1.000 sul coperchio di ciascuna piastra e agitare (Figura 1, adenovirus GFP). Porre le piastre in un incubatore per colture cellulari (37 °C, 5% CO2) e agitare ogni 15 minuti per 1 ora. Continuare l'incubazione per altre 2 ore e poi procedere all'incorporazione delle cellule nel collagene o nella matrice della membrana basale.
- Dopo aver completato il lavoro virale nella cappa, immergere tutti i componenti della cappa con il 10% di candeggina per almeno 15 minuti e poi pulire accuratamente la candeggina con etanolo al 70%.
4. Incorporazione di cellule in Collagene o Matrice della Membrana Basale
- Prepara il gel di collagene con ghiaccio combinando 7 ml di collagene di coda di ratto di tipo I (3,3 mg/mL), 700 μL di terreno 10x Waymouth e 466,6 μL di 0,34 M NaOH.
- Prendendo volumi uguali di gel di collagene e sospensione cellulare, mescolare delicatamente. Se si aggiunge uno stimolo o un inibitore, combinarlo con la sospensione di cellule di collagene. Piastra un pozzetto alla volta (piastre dal passaggio 1.5.3); Mantenendo la piastra sul ghiaccio, agitare per distribuire uniformemente lo strato di cellule di collagene.
- In ogni pozzetto, pipettare i seguenti volumi di sospensione di cellule di collagene: 200 μl (vetrino a 8 pozzetti), 500 μl (piastra a 24 pozzetti), 1000 μl (piastra a 12 pozzetti) o 2000 μl (piastra a 6 pozzetti). Si noti che l'ADM è indotta tramite stimolazione con TGF-α (50 ng/mL) nella Figura 1.
- Per l'incorporazione di cellule nella matrice della membrana basale, mescolare una parte della matrice della membrana basale con una sospensione cellulare in due parti. Come per il collagene, mantenere la sospensione matrice-cellula e la piastra sul ghiaccio. Pipettare un pozzo alla volta utilizzando gli stessi volumi indicati in 4.2.1 e vorticare per una distribuzione uniforme.
- Posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari (37 °C, 5% CO2) per 30 minuti per solidificare e quindi aggiungere 1 terreno completo di Waymouth con qualsiasi stimolo o inibitore (la Figura 1 utilizza il TGF-α a 50 ng/mL). Cambiare il mezzo (con stimolo o inibitore) il giorno successivo e poi a giorni alterni. A seconda dello stimolo, l'ADM può essere osservata tra il giorno 3 e il giorno 5.
