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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
Gli strumenti chirurgici necessari sono mostrati nella Figura 1 e il diagramma schematico della procedura è mostrato nella Figura 2.
1. Soluzioni
- Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) aggiungendo 100 ml di 10X HBSS (da magazzino) a 900 ml di acqua distillata per ottenere 1 litro di HBSS (1X).
- Preparare la soluzione STOP (deve essere preparata fresca e deve essere utilizzata entro 1 ora) aggiungendo 50 mL di siero fetale bovino (FBS) 100X a 450 mL di 1X HBSS ghiacciato; questo produce 500 mL di soluzione STOP. Mantenere la soluzione STOP a 4 °C.
- Preparare la soluzione di collagenasi P (deve essere preparata fresca entro 1 ora dall'uso) aggiungendo 1 mg/mL di collagenasi P a 1X HBSS ghiacciato; utilizzare 6 mL/topo.
- Aggiungere lo 0,05% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) alla soluzione di collagenasi P (questo fornisce nutrienti alle isole isolate). Ad esempio, utilizzare 3 mg di BSA in 6 ml di soluzione di collagenasi P. Tenere in ghiaccio.
- Calcola e prepara la quantità di collagenasi P necessaria per tutti i topi in una provetta da 50 ml.
- Preparare il terreno RPMI 1640 completo aggiungendo il 10% di FBS, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, l'integratore di cellule INS-1 (10 mM di HEPES, 2 mM di L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio e 0,05 mM di 2-mercaptoetanolo) a 500 mL di terreno RPMI 1640 contenenti 5,5 mM di glucosio da utilizzare per la coltura e l'incubazione notturne.
2. Preparazione
- Riempire tre provette da 50 mL di soluzione inibitrice della RNasi da 25 mL, etanolo al 70% o H2O distillato. Queste soluzioni verranno utilizzate per la pulizia degli strumenti chirurgici prima e durante la procedura.
- Immergere le punte degli strumenti nella soluzione inibitrice della RNasi per 30 minuti prima di iniziare il protocollo; questo elimina qualsiasi potenziale RNasi sugli strumenti.
- Tamponi assorbenti pretagliati di dimensioni 6 x 6 per l'uso durante l'intervento chirurgico.
- Preparare in anticipo la soluzione 1X HBSS e conservarla a 4 °C. Preparare la soluzione STOP prima dell'intervento chirurgico. Conservare a 4 °C.
- Preparare la soluzione di collagenasi P immediatamente prima dell'intervento chirurgico e conservare su ghiaccio.
nota: Questo dovrebbe essere utilizzato entro 2 ore dalla preparazione.
- Etichettare le provette da 50 ml per la digestione e la purificazione; preparare 2 provette per ogni topo, una per la digestione e l'altra per la purificazione delle isole. Assicurarsi che l'ID dell'animale sia su entrambi i tubi.
- Aggiungere 3 mL di soluzione di collagenasi P nella prima provetta da 50 mL. Verranno iniettati i restanti 3 ml di collagenasi P.
- Aspirare i restanti 3 mL di soluzione di collagenasi in una siringa da 3 mL montata con 30 G 1/2 in ago. Metti la siringa sul ghiaccio.
3. Procedura
- Rimuovere tutti gli strumenti dalla soluzione inibitrice della RNasi, quindi immergerli prima nel tubo con etanolo al 70%, poi nel tubo contenente H2O distillato, quindi asciugare all'aria su un tovagliolo di carta pulito.
- Mettere il topo in una camera contenente 0,5 mL di isoflurano fino a quando il topo non è profondamente anestetizzato.
- Rimuovere il mouse dalla camera e controllare lo stato di anestesia pizzicando un cuscinetto per i piedi con una pinza. L'anestesia profonda si basa sull'osservazione che la respirazione diventa costantemente lenta e il topo non è reattivo al pizzicamento del piede. Dopo aver confermato che il topo è profondamente anestetizzato, sopprimere il topo con lussazione cervicale, quindi posizionare il mouse sul tampone assorbente.
- Posizionare il topo anestetizzato sullo stomaco, esercitando pressione sul collo e dislocando la colonna vertebrale dal cervello tirando la coda.
- Fissare gli arti del mouse in posizione supina al tampone assorbente, spruzzare il corpo con etanolo al 70% e rimuovere l'eccesso di etanolo.
- Utilizzare una pinza per vetro di copertura e forbici chirurgiche curve per praticare incisioni. Per prima cosa praticare un'incisione orizzontale sulla pelle della zona addominale (~3 cm), spalancare la pelle per esporre la parete addominale. Quindi praticare un'incisione verticale (~3-4 cm) sul peritoneo addominale per esporre completamente il pancreas nella cavità addominale (Figura 3).
- Spingi i lobi del fegato superiormente per esporre il dotto biliare, apparirà come un tubo rosa pallido (Figura 3).
- Spostare con cautela l'intestino dalla regione lombare/iliaca destra della cavità addominale a destra, esponendo il dotto biliare e l'arteria epatica (Figura 3).
- Bloccare con cura il dotto biliare comune utilizzando le micro serrefine di Schwartz (Figura 1) il più vicino possibile al fegato.
- Identificare l'ampolla di Vater, che si trova in corrispondenza della papilla duodenale, formata dall'unione del dotto pancreatico e del dotto biliare comune. L'ampolla di Vater appare gonfia se osservata al microscopio da dissezione, che è il punto di ingresso al dotto biliare comune (Figura 4).
nota: La regolazione dell'intensità/angolo della luce del microscopio di dissezione può facilitarne la localizzazione.
- Inserire la siringa con 3 mL della soluzione di collagenasi P nell'ampolla di Vater. Spingere l'ago nel dotto per circa 1/4 della lunghezza del dotto biliare comune (l'ampolla conduce nel dotto) come mostrato nella Figura 5.
- Una volta che l'ago è nell'ampolla, assicurarsi che l'orientamento dell'ago sia tale da essere parallelo al condotto.
- Stabilizzare l'ago bloccandolo con una pinza micro Adson per evitare che fori il dotto (Figura 5).
- Iniettare lentamente e costantemente 3 mL della soluzione di collagenasi P dalla siringa nel dotto biliare comune (abbastanza da avvertire resistenza) come mostrato nella Figura 6. L'obiettivo è creare una pressione di riflusso per costringere la collagenasi a entrare nel dotto pancreatico. L'iniezione è considerata efficace se la testa, il collo, il corpo e la regione della coda del pancreas sono completamente gonfiati.
nota: La resa delle isole sarà bassa se il pancreas non è completamente gonfiato o se l'area splenica non è completamente gonfiata. L'area splenica contiene il maggior numero di isolotti6. L'inflazione può essere confermata dalla comparsa di spazi aperti tra il tessuto pancreatico che sono riempiti di soluzione.
- Sezionare con cura il pancreas gonfiato e metterlo in una provetta per digestione da 50 ml contenente 3 ml di soluzione ghiacciata di collagenasi P.
- Rimuovere il pancreas utilizzando 2 pinze (curve e Micro Adson; Vedi Figura 1): (partendo dalla milza, allontanare il pancreas dalla milza e continuare a rimuoverlo dallo stomaco e lungo il duodeno.
nota: Non sono necessarie incisioni.
- Tritare il pancreas per 3-5 s nella provetta di digestione con 3 ml di soluzione ghiacciata di collagenasi P utilizzando forbici chirurgiche sottili (Figura 7A).
- Fissare la provetta a una griglia in bagnomaria a 37 °C e agitare a 100-120 giri/min per circa 12-13 minuti.
- Dopo l'incubazione, agitare delicatamente le provette a mano per disgregare il tessuto fino a quando la soluzione di digestione della collagenasi P diventa omogenea (Figura 7B). L'omogeneità è confermata da un aspetto simile alla sabbia di particelle fini di pancreas. Di solito sono sufficienti circa 30 secondi di leggera stretta di mano. Tenere la provetta alla luce per verificare se il tessuto è ben omogeneizzato; Agitare per altri ~15 s se necessario.
- Una volta digeriti, posizionare immediatamente le provette sul ghiaccio e aggiungere 40 ml di soluzione STOP ghiacciata per terminare la digestione enzimatica.
nota: A questo punto le provette di digestione possono essere lasciate in ghiaccio fino a 2 ore, se si lavora su più topi.
- Centrifugare la provetta in una centrifuga a secchio oscillante a 300 x g per 30 s (la temperatura della centrifuga è flessibile).
nota: Utilizzare una centrifuga a secchio oscillante in modo che il pellet di tessuto si formi sul fondo della provetta da 50 ml e non sulla parete della provetta; Questo è fondamentale per una migliore resa delle isole.
- Decantare e ripetere la centrifugazione con la soluzione STOP altre 2 volte, travasando la soluzione dopo ogni centrifuga. Utilizzare 20 ml di soluzione STOP per ogni lavaggio successivo.
- Prima di ogni centrifuga, rompere il pellet agitando delicatamente il pellet di tessuto nella provetta da 50 mL in 20 mL di soluzione STOP.
- Risospendere il pellet di tessuto con 40 mL di HBSS ghiacciato e centrifugare a 300 x g per 30 s.
- Decantare e ripetere la centrifugazione utilizzando una centrifuga a secchio oscillante con soluzione HBSS altre due volte, travasando la soluzione dopo ogni centrifuga. Utilizzare 20 ml di HBSS per ogni lavaggio.
- Prima di ogni centrifuga, rompere il pellet per staccarlo dal fondo della provetta agitando delicatamente la provetta contenente 20 ml di soluzione HBSS.
- Dopo l'ultima centrifugazione rimuovere tutto l'HBSS.
- Quindi aggiungere 5 mL di gradiente di densità a temperatura ambiente alla provetta da 50 mL contenente il pellet. Agitare brevemente a bassa velocità fino a quando non si omogeneizza.
- Aggiungere altri 5 mL del gradiente di densità a temperatura ambiente alla provetta da 50 mL. Non vortice/mescolare.
nota: È fondamentale rimanere fermi e fermi in modo da consentire una migliore formazione di pendenza senza interruzioni.
- Pipettare 10 mL di tampone HBSS a temperatura ambiente nella provetta (contenente il gradiente di densità), goccia a goccia delicatamente e lentamente per consentire la formazione di un gradiente. Utilizzare una pipetta con una pipetta da 10 ml per aggiungere HBSS goccia a goccia.
- Utilizzando una centrifuga a secchio oscillante, centrifugare i tubi a 1700 x g per 15 minuti. Assicurarsi di modificare la velocità di accelerazione/decelerazione all'impostazione più bassa per mantenere la pendenza (Figura 7C).
- Dopo la centrifuga, rimuovere con cura i tubi senza disturbare la pendenza. Utilizzando una pistola per pipette pre-inumidita con HBSS freddo (pipetta HBSS su e giù), pipettare lo strato di isole (5-10 mL) formato tra il gradiente di densità e l'HBSS nella nuova provetta di raccolta delle isole da 50 mL.
nota: È utile bagnare la pipetta con HBSS freddo prima di pipettare le isole per evitare che le isole si attacchino alle pareti interne della pipetta.
- Nel caso in cui la separazione sia incompleta, le isole sarebbero visibili nello strato del gradiente di densità, pipettare tutti i 10 mL del gradiente di densità (strato inferiore) insieme allo strato di isole formate all'interfaccia (solo per lasciare circa 8-10 mL dello strato superiore HBSS).
nota: La raccolta sia dello strato di isolotti che dello strato di gradiente di densità (strato inferiore) può comportare la raccolta di detriti che possono allungare il tempo di raccolta degli isolotti, ma nessun altro passaggio verrà alterato. La raccolta di entrambi questi strati non è necessaria quando lo strato di isolotti è ben formato.
- Aggiungere 20 mL di HBSS ghiacciato alla nuova provetta da 50 mL contenente le isole, quindi centrifugare a 350 x g per 3 minuti in una centrifuga a secchiello oscillante.
- Dopo la centrifuga, pipettare con cura (non travasare) il surnatante (lasciare ~3 ml sul fondo) senza disturbare il pellet contenente le isole sul fondo. Scartare il surnatante.
- Ripetere il lavaggio e la centrifugazione almeno 3 volte. Aggiungere 20 ml di HBSS ogni volta e assicurarsi di sospendere il pellet prima di ogni centrifuga.
- Riscaldare il flacone completo del supporto RPMI-1640 a bagnomaria a 37 °C prima dell'uso. Dopo l'ultima centrifugazione, rimuovere tutto l'HBSS e aggiungere 4 ml di terreno RPMI-1640 completo precedentemente preparato (contenente FBS, integratore cellulare INS-1 e penicillina/streptomicina) al pellet.
- Spostare il pellet facendo roteare delicatamente il tubo e versare immediatamente il terreno RPMI-1640 in una piastra Petri da 100 mm. Aggiungere altri 5 ml di terreno RPMI-1640 alla provetta e agitarla delicatamente per lavare via eventuali isolette rimanenti, quindi versare anche il terreno nella stessa piastra di Petri.
- Al microscopio da dissezione, prelevare le isole sane dalla piastra di Petri utilizzando una pipetta da 20 μL e metterle in una nuova piastra di Petri contenente 10 mL di terreno RPMI 1640 completo. Se osservate al microscopio da dissezione, le isole dovrebbero apparire sferiche/oblunghe e di colore bruno-dorato con una superficie liscia rispetto al tessuto esocrino relativamente trasparente e sottile.
nota: L'ingrandimento del microscopio di dissezione è solitamente impostato a 12,5-16x. La resa delle isole varia a seconda di vari fattori tra cui il ceppo, l'età e il sesso del topo. Questo protocollo di solito produce 250-350 isole sane da topi C57BL/6J sani di età compresa tra 4 e 10 mesi.
- Incubare le isole in un incubatore sterile a 37 °C con infusione di CO2 al 5% e aria umidificata al 95% durante la notte per gli esperimenti del giorno successivo, oppure congelare le isole per l'analisi desiderata in un secondo momento.
- Una volta congelate, le isole non possono essere utilizzate per i saggi di secrezione, ma solo per la quantificazione di RNA o proteine. Per raccogliere le cellule da congelare, metterle nel tampone HBSS, raccogliere tutte le isole in 200-500 μL di tampone, trasferirle in una provetta da 1,5 mL, centrifugare 350 x g per 1-2 min, rimuovere il surnatante lasciando non più di 30-40 μL di soluzione, porre a -20 °C per la conservazione a breve termine (diversi giorni) o a -80 °C per la conservazione a lungo termine.
