Isolamento delle isole pancreatiche attraverso la perfusione di collagenasi: un metodo enzimatico per isolare le cellule delle isole pancreatiche

Abstract

Source: Villarreal D. et al. Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isole pancreatiche dai topi. J. Vis. Exp. (2019)

Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che producono ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Questo protocollo spiega un metodo per isolare le isole pancreatiche mediante prima perfusione di collagenasi tramite l'ampolla di Vater per digerire il tessuto pancreatico esocrino e una centrifugazione semplificata in gradiente di densità per purificare le isole dai topi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

Gli strumenti chirurgici necessari sono mostrati nella Figura 1 e il diagramma schematico della procedura è mostrato nella Figura 2.

1. Soluzioni

1. Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) aggiungendo 100 ml di 10X HBSS (da magazzino) a 900 ml di acqua distillata per ottenere 1 litro di HBSS (1X).
2. Preparare la soluzione STOP (deve essere preparata fresca e deve e....

Risultati

Figura 1: Strumenti chirurgici.
Vengono mostrate le forbici chirurgiche curve, le pinze in vetro di copertura, le pinze micro Adson, le pinze curve, le piccole forbici chirurgiche e le micro serrefine di Schwartz (morsetto microvascolare). Clicca qui per visualizzare una versione più gr.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 3 ml	Bd	309657	Mantenimento della collagenasi P
Pinze per vetri di copertura	VWR	82027-396	Tenere la pelle del topo per facilitare la procedura di incisione
Pinze curve	Sigma-Aldrich	Z168696	Trattenere i tessuti durante la rimozione del pancreas
Piastre di Petri da 100 mm	VWR	Codice: 30-2041	Utilizzato per la coltura delle isole
Ago da 30 G. 1/2 pollice	Bd	305106	Per la penetrazione dell'ampolla del vater per fornire collagenasi P - questo calibro viene utilizzato in quanto si adatta bene alla maggior parte dei CBD
Tubo da 50 ml	VWR	Codice 89039-658	Mantenimento del tessuto pancreatico digerito, della collagenasi P e delle isole purificate
Cuscinetti assorbenti con impermeabilità barriera all'umidità	VWR	82020-845	Per assorbire il sangue dalle procedure chirurgiche
Centrifuga 5810R con swing benna e capacità di decelerazione	Eppendorf	Codice: 5811FJ478114	Utilizzare per la pellettatura dei tessuti, il pellet si forma sul fondo del tubo conico - è necessaria una centrifuga a secchiello oscillante. Anche la funzione di dichiarazione è importante per formare i livelli di gradiente
Collagenasi P- 1g	Roche Diagnostics	11249002001	Per la digestione del pancreas esocrino
Forbici chirurgiche curve	Fisher-Scientifico	13-804-21	Per tagliare l'addome aperto del topo
Microscopio di dissezione	Olimpo	SZX16	Utilizzato per l'identificazione di strutture anatomiche chiave per Rilasciare la collagenasi nel pancreas
Soluzione salina bilanciata di Hank 10x	Corning	20-023-CV	Celle di lavaggio
Histopaque-1077	sigma	RNBF5100	Per la formazione del gradiente
sorgente luminosa	Leeds	LR92240	Miglioramento della visibilità del microscopio
RPMI-1640 Terreni senza L-glutammina	Corning	15-040-CV	Coltivare gli isolotti
Micro serrefines di Schwartz (Morsetto microvascolare)	Strumenti per la scienza	Codice: 18052-01	Clampaggio del dotto biliare comune e arteria epatica
Bagno d'acqua tremante	Boekel/Grant	8R0534008	Importante per la digestione meccanica del tessuto esocrino
Piccole forbici chirurgiche	VWR	Codice 82027-578	Taglio del tessuto che si attacca al pancreas
RNaseZap	Fisher-Scientifico	AM9780	Per la rimozione della RNasi
Isoflurano	Piramal	B13B16A	Per anestetizzare i topi prima dell'intervento chirurgico