Colorazione immunofluorescente di sferoidi: una tecnica per analizzare gli sferoidi per l'espressione dell'espressione intra ed extracellulare dell'antigene

1. Colorazione immunofluorescente di sferoidi

1. Raccogliere gli sferoidi dopo circa 24 ore in una provetta di reazione da 1,5 mL per condizione sperimentale o per proteina da analizzare. Ad esempio, posizionare gli sferoidi degli iNF stimolati con TGF-β1 in una provetta diversa dagli iNF di controllo, che non sono stati trattati. Per evitare la rottura degli sferoidi a causa di forze di taglio troppo forti, tagliare l'estremità della punta della pipetta per allargare l'orifizio. Includere almeno 5-10 sferoidi in una provetta di reazione, per consentire le repliche e tenere conto delle possibili perdite durante le fasi di lavaggio.
2. Centrifugare gli sferoidi con una centrifuga da banco per circa 30-60 s a 1.000 x g. Rimuovere con cautela il surnatante contenente metilcellulosa mediante pipettaggio, senza disturbare gli sferoidi pellettati.
3. Lavare con 50 μl di 1x PBS. Ripetere la fase di centrifugazione e rimuovere con cautela il PBS mediante pipettaggio, come descritto al punto 1.2.
4. A seconda della proteina da colorare, fissare con 50 μL di paraformaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente (per αSMA, NG2 e integrina α3β1) o con 50 μL di metanolo per 10 minuti a -20 °C (per subunità di laminina-332).
5. Ripetere la fase di lavaggio come spiegato nei passaggi 1.2-1.3.
6. Permeabilizzare le celle con Triton-X allo 0,1% in PBS per 4 minuti a temperatura ambiente.
7. Ripetere la fase di lavaggio come spiegato nei passaggi 1.2-1.3 tre volte.
8. Incubare gli sferoidi in PBS contenente il 5% di FBS e il 2% di BSA, per 1 ora a RT per bloccare i siti di interazione proteica non specifici.
9. Incubare gli sferoidi con 30 μL di anticorpi primari in PBS, 2,5% FBS e 1% BSA a 4 °C durante la notte. Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: anti-αSMA Cy-3 coniugato e anti-NG2 a 5 μg/mL; BM2 anti-laminina α3, 6F12 anti-laminina β3 e anti-laminina γ2 20 μg/mL.
10. Ripetere la fase di lavaggio come spiegato nei passaggi 1.2-1.3 tre volte.
11. Incubare gli sferoidi con 30 μL di anticorpi secondari in PBS, 2,5% FBS e 1% BSA a RT per 90 minuti. I seguenti anticorpi secondari utilizzati sono stati: Alexa 488 anti-coniglio e anti-topo (5 μg/mL).
12. Ripetere la fase di lavaggio come spiegato nei passaggi 1.2-1.3 tre volte.
13. Incubare le cellule con 30 μL di soluzione colorante DAPI per 4 minuti a temperatura ambiente.
14. Ripetere la fase di lavaggio come spiegato nei passaggi 1.2-1.3.
15. Posizionare gli sferoidi su un vetrino, in una goccia di PBS, utilizzando una pipetta di vetro Pasteur.
16. Imaging degli sferoidi mediante microscopia a fluorescenza in un microscopio a scansione laser utilizzando un ingrandimento di 10x. Prendi una diversa sezione d'urto ottica dello sferoide su diversi piani ottici di una pila z (15-20 piani pila). Per stabilire le impostazioni del laser nel microscopio, utilizzare uno sferoide composto da cellule negative per l'antigene di interesse o uno sferoide colorato solo con l'anticorpo secondario. Riutilizzare le stesse impostazioni per tutti i campioni che verranno confrontati.
17. Analizza le immagini microscopiche con il software ImageJ pubblicato in precedenza. I passaggi sono riepilogati nella Figura 1. Come sfondo, determinare la densità del segnale integrato di una regione di interesse (ROI) priva di cellule. Calcolare la fluorescenza cellulare totale corretta (TCCF) come:
    TCCF = densità del segnale integrato - (area dello sferoide selezionato x fluorescenza media del fondo)
18. Determinare la fluorescenza totale corretta (TCF) degli sferoidi come TCCF normalizzato all'area dello sferoide e al numero di pile.
    TCF = TCCF di sferoidi / (area di sferoidi x numero di pile)

Figura 1. Passaggi sequenziali per la quantificazione della colorazione immunofluorescente di una proteina di interesse negli sferoidi, utilizzando ImageJ. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.