Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di jove.
1. IRE dei tumori SQ
- Preparare i materiali necessari: elettroporatore a onda quadra, interruttore di sicurezza a pedale, elettrodi (array di aghi o pinzette) e adattatori. Tenere a portata di mano punti di sutura sterili (non assorbibili 4-0), tamponi imbevuti di alcol, tagliacapelli, crema depilatoria, lubrificante per gli occhi, garza di cotone, buprenorfina e anestetici.
- Sterilizzare gli elettrodi a pinzetta o ad ago utilizzando la sterilizzazione a gas. La sterilizzazione in autoclave non è consigliata. Utilizzare uno sterilizzatore a perle di vetro per sterilizzare gli elettrodi tra gli animali.
- Seguire i passaggi per indurre con successo l'anestesia nei topi una volta che l'impianto tumorale SQ raggiunge il diametro di 5 mm. In breve, somministrare al topo ricevente 0,05 - 1 mg/kg di buprenorfina analgesico SQ, 30 minuti prima dell'intervento chirurgico. Quindi, anestetizzare i topi riceventi con isoflurano al 2-3% in ossigeno (2 L/min) utilizzando un vaporizzatore di precisione (o altri agenti anestetici). Tenere i mouse su un termoforo a 37 °C per l'intera procedura. Applicare lubrificante sugli occhi per prevenire l'essiccazione. Testare la profondità dell'anestesia in base alla mancanza di un riflesso sorprendente inizialmente e confermare l'anestesia sul piano chirurgico in base alla mancanza di riflesso del pedale per un leggero pizzicamento delle dita dei piedi. Mantenere l'anestesia durante l'intera procedura chirurgica.
- Posizionare il topo anestetizzato su un lato per accedere al tumore SQ sul fianco. Rimuovere i peli con un tagliacapelli e pulire la pelle con un tampone imbevuto di alcol.
- Per i tumori SQ, utilizzare elettrodi array a 2 aghi. Sollevare la pelle direttamente sotto il sito tumorale utilizzando una pinza e inserire gli elettrodi attraverso la pelle parallelamente al corpo assicurandosi che non penetrino nella cavità peritoneale. Una volta attraverso la pelle, posizionare gli elettrodi in modo tale da avvolgere il tumore.
- Programmare l'elettroporatore per erogare impulsi di 100 μs a una frequenza di 1 Hz a 1.500 V/cm per un totale di 150 impulsi. Erogare gli impulsi utilizzando il pedale. Separare ogni serie di 10 impulsi di 10 secondi, al fine di consentire la dissipazione del calore e confermare la corretta posizione degli elettrodi.
nota: Senza l'uso di agenti paralitici, i topi sperimenteranno contrazioni muscolari con IRE che possono causare lo spostamento degli elettrodi a meno che non siano fissati manualmente.
- Rimuovere gli elettrodi dopo il dosaggio completo, che non deve superare i 200 s. Registrare la tensione effettiva erogata, che viene visualizzata sull'elettroporatore. Consenti ai topi di riprendersi dopo l'IRE nella sua gabbia domestica con libero accesso a cibo e acqua. Posiziona la gabbia su un termoforo per facilitare il recupero. Monitorare i segni vitali come respirazione, perfusione, ecc., durante il processo di recupero. Confermare i segni del riflesso di raddrizzamento una volta che il mouse si riprende, quindi riportare la lattina della gabbia al normale alloggiamento. Somministrare buprenorfina 0,05 - 0,1 mg/kg 8 - 12 ore dopo l'intervento e ogni 8 - 12 ore dopo la procedura, se necessario per i segni di dolore.
2. IRE dei tumori ortotopici
NOTA: L'IRE dei tumori ortotopici comporta un secondo intervento chirurgico di sopravvivenza sullo stesso topo, richiedendo quindi un'approvazione speciale da parte dell'IACUC locale prima di iniziare.
- Preparare i materiali necessari: sterilizzare in autoclave gli strumenti chirurgici come forbici, bisturi, cacciaaghi, pinze appuntite e pinze a punta piatta. Tenere a portata di mano anche i seguenti suture: suture sterili (assorbibili 6-0 e non assorbibili 4-0), tamponi imbevuti di alcol, tagliacapelli, crema depilatoria, lubrificante per gli occhi, garza di cotone, soluzione di iodio povidone al 10%, teli chirurgici, cuscinetti riscaldanti, elettroporatore a onda quadra, interruttore di sicurezza a pedale, elettrodi e relativi adattatori, buprenorfina e anestetici.
- Valutare i topi per la crescita tumorale ortotopica mediante imaging a bioluminescenza in vivo. Seguire la crescita del tumore mediante imaging a partire dal giorno 4 dopo l'impianto ortotopico ed eseguire l'imaging due volte a settimana. Il giorno dell'imaging, somministrare (iniezione intraperitoneale) 30 mg/kg di D-luciferina a un topo ricevente anestetizzato (2 - 3% di isoflurano in ossigeno (2 L/min)) 10 minuti prima dell'imaging. Immagine per l'attività della luciferasi utilizzando l'impostazione della luminescenza senza filtri di emissione per un'esposizione minima di 5 s in un imager a luminescenza con tavolino riscaldato senza autofluorescenza e mantenendo comunque l'anestesia per i topi.
nota: I tumori ortotopici sono ideali per il trattamento IRE da 8 a 10 giorni dopo l'impianto, quando i tumori sono chiaramente visibili e ancora confinati al pancreas, come si può vedere nelle immagini della luminescenza della luciferasi
- Segui i passaggi per localizzare il tumore impiantato. Somministrare brevemente al topo ricevente 0,05 - 1 mg/kg di analgesico buprenorfina SQ, 30 minuti prima dell'intervento chirurgico. Anestetizzare i topi riceventi con isoflurano al 2-3% in ossigeno (2 L/min) utilizzando un vaporizzatore di precisione (o altri agenti anestetici). Tenere i mouse su un termoforo a 37 °C per l'intera procedura. Applicare lubrificante sugli occhi per prevenire l'essiccazione. Testare la profondità dell'anestesia in base alla mancanza di un riflesso sorprendente inizialmente e confermare l'anestesia sul piano chirurgico in base alla mancanza di riflesso del pedale per un leggero pizzicamento delle dita dei piedi. Mantenere l'anestesia durante l'intera procedura chirurgica. Posiziona il mouse sulla schiena e giralo delicatamente sul lato destro in modo che il lato sinistro dell'addome sia esposto. Rimuovere i peli addominali del topo usando una crema depilatoria e pulire con una garza per assicurarsi che i peli liberi non entrino nell'addome dopo l'incisione. Preparare l'addome sinistro per l'intervento chirurgico utilizzando 3 cicli di iodio povidone al 10% seguiti da salviettine imbevute di alcol per disinfettare la pelle. Utilizzando un bisturi sterile, praticare un'incisione trasversale o obliqua di 1,5 cm nella pelle, 1 cm a sinistra della linea mediana, sotto la gabbia toracica, leggermente mediale rispetto alla milza. Quindi, estendere l'incisione attraverso la muscolatura addominale, rispecchiando l'incisione superficiale sovrastante. Localizzare la milza utilizzando una pinza a punta piatta ed esternarla delicatamente dalla cavità addominale. Ritrarre la milza usando un applicatore di cotone sterile e trovare la coda del pancreas attaccata alla parte inferiore della milza. Usando una pinza a punta piatta, ritrarre lateralmente la coda del pancreas. Se il tumore non è facile da localizzare, usa una pinza a muso smussato per muovere delicatamente lo stomaco e la milza per identificare il tumore.
- Esternalizzare il tumore con una pinza a muso smussato e catturare saldamente il tumore con gli elettrodi di platino della pinzetta. Erogare gli impulsi di elettroporazione come programmato al punto 1.7 utilizzando l'elettroporatore a onda quadra in set di 10 impulsi controllati dall'interruttore a pedale.
- Mantenere il tumore esternalizzato per almeno 60 s dopo l'IRE per monitorare eventuali segni di emorragia. Reinserire il tumore nella cavità addominale e chiudere l'incisione come descritto. In breve, chiudere la muscolatura addominale utilizzando una sutura riassorbibile 6-0 con un punto continuo o interrotto e chiudere la pelle sovrastante utilizzando una sutura interrotta non assorbibile da 3-0 a 6-0. Interrompere l'anestesia a questo punto. Consentire al mouse di recuperare come descritto in 1.7. Monitorare il mouse fino a quando non si riprende.
- Monitorare gli effetti dell'IRE sulla crescita tumorale utilizzando l'imaging in vivo con luciferasi come indicato al punto 2.2.
