Co-colture di sferoidi 3D biostampate magneticamente: un metodo per la co-coltura di cellule cancerose e fibroblasti

Abstract

Fonte: Noel P. et al.Preparazione e analisi metabolica di co-colture di sferoidi tridimensionali di cellule tumorali pancreatiche e fibroblasti. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video spiega la biostampa magnetica 3D di cellule tumorali pancreatiche e fibroblasti co-coltivati. Le cellule tumorali del pancreas e le cellule dei fibroblasti pancreatici attivati vengono co-coltivate e magnetizzate utilizzando un assemblaggio di nanoparticelle biocompatibili, per generare sferoidi, sotto l'influenza delle forze magnetiche.

Protocollo

1.Coltura di sferoidi 3D per cancro al pancreas con bioprinting magnetico

1. Utilizzando la tecnica standard di coltura tissutale asettica, le cellule di interesse vengono coltivate in un pallone T75 a una confluenza del 70-80% in terreni di crescita appropriati.
   nota: Tipicamente, sono state raccolte 5-7 × 10⁶ celle da un pallone di T75 confluente al 70-80%. In questo studio sono stati utilizzati due diversi tipi di cellule: Patu8902 (cellule tumorali pancreatiche) e cellule PS1 (cellule stellate pancreatiche attivate). Entrambe le linee cellulari sono state coltivate nel terreno 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) integrato con il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS), l'1× penicillina-streptomicina (p/s).
2. Lavare le celle una volta con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS).
3. Staccare le cellule dalla superficie di plastica tripsinizzando con 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% per 5-10 minuti a 37 °C. Verificare la presenza di distacco di cellule al microscopio.
4. Disattivare la tripsina aggiungendo 8 mL di terreno di coltura alle cellule staccate. Evitare l'eccessiva tripsinizzazione, in quanto ciò può influire negativamente sulla salute/vitalità delle cellule.
5. Pipettare le cellule verso l'alto e verso il basso per generare una singola sospensione cellulare e contare la densità cellulare utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro.
6. Nel frattempo, equilibrare una fiala di NS a temperatura ambiente.
7. Calcolare la quantità di cellule necessarie per la semina del numero desiderato di sferoidi (pozzetti) e aliquotare in una nuova provetta conica da 15 mL. Ad esempio, per seminare un'intera piastra a 96 pozzetti con 5.000 celle/pozzetto, aliquotare almeno 5,5 × 10⁵ celle.
8. Raccogliere le cellule centrifugando a 500 x g per 3 minuti. Asp irate o decantare con cura il surnatante e risospendere le cellule a una concentrazione di 1,0 x 10⁶ cellule/mL in terreno di crescita. Pipettare delicatamente utilizzando una punta per pipetta a foro largo per evitare il taglio. Ad esempio, risospendere 5,5 x 10⁵ cellule in 550 μl di terreno di crescita.
9. Magnetizzare la quantità desiderata di cellule utilizzando l'NS equilibrato (passaggio 1.6).
   1. Aggiungere direttamente NS alla sospensione cellulare nei terreni di crescita e agitare delicatamente. Per un'efficiente marcatura magnetica delle cellule, utilizzare 10 μL NS per 100 μL di cellule (risospese a 1 x 10⁶ cellule/mL).
      nota: Per un esperimento tipico, etichettare 5,5×10⁵ cellule Patu8902 in 550 μL con 55 μL NS e 1,1×10⁶ cellule PS1 in 1100 μL, (separatamente) con 110 μL NS.
   2. Capovolgere delicatamente il tubo alcune volte per garantire la sospensione cellulare. Trasferire temporaneamente, la miscela cellula-NS in un singolo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Fallo separatamente per ogni tipo di cella da magnetizzare. Coprire la piastra e incubare le cellule a temperatura ambiente per 2 ore agitando delicatamente per consentire il legame delle NS alla superficie cellulare.
      nota: La coltura e il saggio di sferoidi a partire da cellule da sole Patu8902 o PS1, oltre a sferoidi di co-coltura a partire da entrambi i tipi di cellule premiscelati prima della stampa su unità magnetiche, sono stati ottenuti con successo utilizzando questo metodo in esperimenti indipendenti. Un metodo per generare sferoidi di co-coltura da cellule Patu8902 e PS2 è descritto di seguito nelle fasi successive.
10. Pipet su e giù delicatamente le celle magnetizzate per mescolarle uniformemente e preparare una miscela master contenente il numero di cellule desiderato. Per la semina degli sferoidi, utilizzare un totale di 15.000 cellule (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) e regolare a un volume totale di 150 μl per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
    nota: Il volume finale erogato in ciascun pozzetto deve essere lo stesso, indipendentemente dal numero di cellule utilizzate.
11. Posizionare una piastra repellente per cellule a 96 pozzetti sopra l'unità sferoidale magnetica a 96 pozzetti ed erogare 150 μl di miscela cellulare in ciascun pozzetto. Osserva le celle raccogliersi lentamente al centro del pozzetto sopra il magnete. Coprire e incubare la piastra per una notte in un'incubatrice al 5% di CO₂ impostata a 37 °C con l'unità sferoidale magnetica ancora collegata. Rimuovere l'unità magnetica e incubare per un'ulteriore crescita fino a 7 giorni.
    nota: È fondamentale utilizzare piastre di crescita repellenti per le cellule per la stampa di sferoidi utilizzando unità magnetiche per sferoidi. Assicurarsi che venga utilizzato l'azionamento sferoidale con magneti più piccoli e sottili, non l'azionamento di tenuta.
12. Monitora la crescita degli sferoidi ogni giorno. Rabboccare con terreno di coltura fresco ogni tre giorni posizionando la piastra di crescita montata sull'unità di supporto magnetico in un angolo e utilizzando una pipetta multicanale per estrarre il terreno esaurito.
    nota: Le cellule Patu8902 e PS1 co-seminate a 15.000 cellule/pozzetto cresceranno in sferoidi 3D con un diametro di 400-600 μm entro 5-7 giorni. A questo punto gli sferoidi sono pronti per la caratterizzazione metabolica, la valutazione dei farmaci e altre applicazioni a valle.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,05% tripsina EDTA	sigma	Codice 25300-054
Piastra repellente per celle a 96 pozzetti	USA Scientifico/ Griener Bio-One	Codice 655970	cartilagine di accrescimento sferoidale
Cellometria Vetrini per conteggio cellulare	Nexcelom	CHT4-SD100-002
n3D Unità sferoidale magnetica	Bioscienze Nano3D	655841	Parte del kit di biostampa Spheroid
Tenuta sferoidale magnetica n3D Guida	Bioscienze Nano3D	655841	Parte del kit di biostampa Spheroid
n3D NanoShuttle-PL	Bioscienze Nano3D	655841	Parte del kit di biostampa Spheroid: conservare a 4 °C
Celle Patu8902	Stock da laboratorio		Adenocarcinoma duttale pancreatico cellule
Celle PS1	Stock da laboratorio		cellule stellate pancreatiche attivate
RPMI1640	Gibco	Codice 11875-093	terreni di crescita per cellule, sferoidi