1. Saggio metabolico di sferoidi tumorali pancreatici 3D per percorsi bioenergetici utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare
NOTA: In questa sezione viene descritta l'analisi delle funzioni metaboliche degli sferoidi utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare con micropiastre di analisi appositamente progettate per sferoidi 3D.
- Lavaggio e trasferimento di sferoidi da piastre di crescita a micropiastre per saggi di sferoidi.
nota: Gli sferoidi possono essere utilizzati per saggi metabolici quando raggiungono un diametro di ~500 μm.
- Il giorno prima di eseguire il test, idratare la sonda o la cartuccia del sensore con il calibratore del saggio (200 μL/pozzetto) nella piastra di utilità fornita e incubare per una notte (4-18 ore) in un incubatore umidificato (non CO2) impostato a 37 °C.
- Preparare il terreno di analisi appropriato per il test metabolico desiderato integrando il terreno di base (vedere la Tabella dei materiali) con 2 mM di L-glutammina per il test da sforzo di glicolisi (GST) o con 1 mM di piruvato, 2 mM di L-glutammina e 10 mM di glucosio per un test da sforzo mitocondriale (MST).
nota: L'analizzatore di flusso extracellulare misura sia la respirazione mitocondriale (OCR) che la glicolisi (ECAR) di cellule vive in un formato di piastra a 96 pozzetti. Questi tassi forniscono una panoramica della funzione metabolica cellulare nei campioni in esame. Fare riferimento al manuale nei kit di analisi per istruzioni dettagliate.
- Dopo aver aggiunto integratori specifici per il test (fare riferimento al passaggio 1.1.1), riscaldare il terreno di coltura integrato in un bagno d'acqua a 37 °C e regolare il pH a 7,4 ± 0,1 con NaOH 0,1N. Mantieni il mezzo caldo fino all'uso.
- Ricostituire i reagenti del kit di test nel terreno di prova calibrato alle concentrazioni stock raccomandate.
nota: Questi vengono effettuati al 10× della concentrazione finale desiderata nei pozzi. Le concentrazioni stock di glucosio, oligomicina e 2-desossiglucosio (2-DG) sono rispettivamente di 100 mM, 100 μM e 500 mM.
- Osservare gli sferoidi nella cartilagine di accrescimento al microscopio ottico per verificare la morfologia degli sferoidi e l'uniformità complessiva, in termini di forma e struttura degli sferoidi.
- Trasferire la piastra di crescita su un dispositivo di supporto magnetico e aspirare con cautela ~120 μL di terreno di crescita. Lavare delicatamente gli sferoidi con ~120 μl di terreno di prova riscaldato e precalibrato, aspirare e ripetere il lavaggio due volte. Ispezionare nuovamente gli sferoidi al microscopio per assicurarsi che gli sferoidi non vengano lavati via.
- Preparare la micropiastra per il saggio degli sferoidi aggiungendo 180 μl di terreno di coltura caldo a ciascun pozzetto.
- Impostare una micropipetta P20 a 10 μl e inserire una punta con foro largo. Se non sono disponibili puntali a foro largo, tagliare i puntali dei normali puntali per pipette con una forbice o un bisturi puliti per allargare il foro.
nota: Ciò dovrebbe ridurre il taglio e preservare la morfologia complessiva degli sferoidi durante il trasferimento su piastre di saggio.
- Utilizzare una superficie calda (37°C) per eseguire il trasferimento degli sferoidi. Utilizzare una superficie del visualizzatore di pellicole a raggi X riscaldata con una lampada a luce bianca per migliorare il contrasto e facilitare la visualizzazione degli sferoidi durante il processo di trasferimento.
- Aspirare con cautela un singolo sferoide prelavato dalla piastra di crescita repellente per cellule utilizzando una micropipetta P20 dotata di una punta a foro largo e trasferire delicatamente lo sferoide direttamente al centro di ciascun pozzetto di una piastra per il saggio degli sferoidi per eseguire il test metabolico. Lasciare che ogni sferoide cada delicatamente nella microcamera centrale di ciascun pozzetto per pura gravità per popolare la piastra del saggio.
nota: Di solito ci vogliono 5-8 s perché ogni sferoide cada al centro del pozzo per gravità. Non estrarre la pipetta fino a quando gli sferoidi non si sono depositati nella microcamera. Non depositare sferoidi nei 4 pozzetti angolari della piastra di analisi (A1, A12, H1, H12) poiché questi verranno utilizzati come pozzetti di fondo.
- Monitora la morfologia e la posizione di ogni sferoide per assicurarti che ogni sferoide sia al centro di ogni pozzo. Se necessario, riposizionare al centro del pozzetto aspirando lo sferoide utilizzando una punta di pipetta a foro largo e successiva deposizione per gravità.
- Una volta che tutti gli sferoidi sono stati trasferiti, collocare la piastra di analisi in un incubatore ad aria umidificata a 37 °C (non CO2) per un'ora prima del saggio.
- Caricamento della cartuccia del sensore con i composti ed esecuzione del test
- Preparare 10× reagenti specifici per il saggio concentrati nei terreni specifici per il saggio descritti al punto 1.1.2. Ad esempio, per eseguire la GST, ricostituire il glucosio, l'oligomicina e il 2-DG nei volumi raccomandati indicati nel manuale del test. Entrambi i saggi GST e MST sono stati eseguiti utilizzando sferoidi Patu8902-PS1.
- Orientare correttamente la cartuccia del sensore con le righe etichettate A-H sul lato sinistro e posizionare una guida di caricamento sopra la cartuccia del sensore. Assicurarsi che la porta desiderata sia caricata correttamente orientando la guida di caricamento in modo che la lettera corrispondente alla porta da caricare si trovi nell'angolo in alto a sinistra.
- Utilizzando una pipetta multicanale, erogare i reagenti direttamente nelle porte di iniezione. Tenere le guide di caricamento in posizione utilizzando la punta delle dita durante la procedura.
nota: Ogni reagente verrà iniettato in una porta consigliata indicata nel manuale del test. Evitare di creare bolle d'aria, ma non picchiettare alcuna parte della cartuccia per rimuovere le bolle d'aria.
- Rimuovere la guida di caricamento e posizionarla all'altezza degli occhi con la cartuccia per ispezionare visivamente le porte di iniezione per un caricamento uniforme.
- Creare il protocollo sperimentale di progettazione del saggio/dello strumento utilizzando il software Wave del controller dello strumento (d'ora in avanti, software di analisi) come descritto nella sezione 1.3.
- Progettazione ed esecuzione di saggi utilizzando il software di analisi
- Creare un modello di saggio per l'esperimento
- Aprire il software di analisi e fare clic su "Modelli" o scegliere da un modello di analisi esistente. Fare doppio clic su "Modello vuoto".
- Definire gruppi e condizioni sperimentali.
- Definire le strategie di iniezione per le porte A, B e C. Lasciare vuota la porta D.
nota: Per il test GST, solo queste porte saranno caricate con glucosio, oligomicina e 2-DG. In caso di test MST, verranno caricati oligomicina, FCCP e rotenone.
- Definire i pre-trattamenti se gli sferoidi sono stati trattati con uno o più composti di prova e il gruppo di controllo. Definire i terreni di analisi in modo da includere la fonte, i supplementi e altre informazioni.
- Definisci uno o più tipi di celle (es. Patu8902, PS1) visualizzando le informazioni sulla densità e sul numero di passaggio.
- Fai clic su "Genera gruppi".
- Fare clic sulla scheda "Mappa piastra" e assegnare gruppi alla piastra di analisi corrispondente al progetto sperimentale.
- Seleziona i quattro pozzetti d'angolo come pozzetti di sfondo. Assicurarsi che non ci siano sferoidi in questi pozzetti.
- Esecuzione del test sull'analizzatore
- Fare clic sulla scheda Protocollo strumento. Mantenere i comandi di protocollo predefiniti selezionando "Calibra", "Equilibra" e "Ciclo di misurazione di base".
- Fare clic su "Iniezioni" e definire il composto per ogni porta. Modifica i cicli di misurazione a 6 cicli dai 3 cicli predefiniti per gli sferoidi. Mantieni i tempi di mixaggio predefiniti di 3 minuti, 0 minuti di attesa e 3 minuti di misurazione.
nota: I tempi predefiniti di mix-wait-measure sono rispettivamente 3 min, 0 min, 3 min. In genere vengono effettuate tre misurazioni della velocità basale prima dell'iniezione del primo composto del test. Queste misurazioni possono essere calibrate e riaggiustate secondo il disegno sperimentale.
- Protocollo di revisione e riepilogo del gruppo.
- Salva il modello di progettazione del saggio.
- Procedere alla calibrazione pre-test una volta che le porte di iniezione sono state caricate con i substrati del saggio. Trasferire la cartuccia con la piastra di servizio all'analizzatore di flusso extracellulare.
nota: Questo di solito viene completato entro 15-20 minuti e calibra i sensori per condurre misurazioni OCR ed ECAR.
- Dopo la calibrazione della cartuccia, sostituire la piastra di servizio con la piastra di analisi preriscaldata contenente sferoidi 3D e avviare il saggio. Una volta completate le misurazioni, esportare i dati in un foglio di calcolo o in un software grafico e statistico per analizzare i dati.
