Modello murino ortotopico fluorescente: impianto di cellule tumorali che esprimono GFP nel topo per valutare la progressione del tumore in vivo

Abstract

Fonte: Moreno, J. A., et al. Modello murino ortotopico fluorescente di cancro al pancreas. J. Vis. Exp.(2016)

Questo video dimostra il protocollo per l'impianto ortotopico di cellule tumorali pancreatiche fluorescenti verdi che esprimono proteine nel pancreas del topo. Il modello murino ortotopico aiuta a studiare l'efficacia di nuove terapie su tumori primari e metastatici.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di jove.

1. Impianto chirurgico

NOTA: Assicurati che tutti i materiali e gli strumenti chirurgici siano sterili. Pratica sempre le tecniche asettiche.

1. Posizionare un termoforo sul tavolo e coprire con un telo sterile. Installa la macchina per anestesia e assicurati che tutte le forniture siano a portata di mano.
2. Posizionare il muso dell'animale nella maschera per anestesia e impostare l'anestesia a 1 L/min di ossigeno e isoflurano al 2,5%.
3. Strofinare delicatamente il fianco dell'animale con iodio e risciacquare con etanolo al 70%. Ripeti tre volte.
4. Conferma che l'animale è completamente anestetizzato pizzicando la zampa posteriore. L'animale è completamente anestetizzato e pronto per l'intervento chirurgico se non si osserva alcuna risposta. Tuttavia, se l'animale sussulta, assicurati che ci sia sufficiente anestesia nel vaporizzatore e concedi all'animale più tempo per passare completamente sotto anestesia.
5. Caricare circa 200 μl della sospensione cellulare in una siringa TB da 1,0 ml con un ago da 18 G (precedentemente raffreddato). Sostituire l'ago con un ago da 27 G e rimettere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
6. Individua l'area generale della milza (quadrante superiore sinistro dell'addome) e usando il forcipe pizzica la pelle sopra quella regione. Utilizzando le forbici chirurgiche, praticare un'incisione di circa 1,0 cm per creare una tasca. Allo stesso modo, pizzica il muscolo liscio sopra la milza e taglialo per accedere alla cavità peritoneale.
7. Afferra delicatamente l'estremità caudale della milza ed estraila dal corpo. Il pancreas sarà attaccato alla milza. Allargare il pancreas utilizzando un cotton fioc sterile umido e individuare la coda del pancreas.
8. Somministrare l'iniezione di 50 μl nella coda del pancreas, lasciare l'ago all'interno per 10 secondi e ruotare lentamente l'ago fuori dal pancreas. Un impianto riuscito apparirà come una bolla superficiale senza perdite.
9. Riportare il pancreas e la milza nella cavità peritoneale. Prima racchiudere il muscolo e poi racchiudere la pelle separatamente. Usa una sutura o una graffetta 6-0 per chiudere l'incisione. Per evitare dolore nell'animale, somministrare ketoprofene per via sottocutanea (SC) (5 mg/kg) nell'arco di 24 ore. In alternativa, somministrare buprenorfina sc (0,05 - 0,1 mg/kg) ogni 12 ore per un periodo di 36 ore.
10. Recupera l'animale dall'anestesia e rimettilo nella sua gabbia. Monitorare anche il dolore. Gli animali devono essere dotati di sollievo dal dolore al momento dell'intervento chirurgico preventivo (o anche prima). Agli animali che avvertono dolore devono essere forniti ulteriori sollievo dal dolore secondo il protocollo IACCUC o come prescritto dal veterinario curante o da un suo delegato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Alcare o Schiumogeno Antisettico Strofinamento Mani	Steris	Codice 639680
TB siringa 27 g 1/2	Becton Dickinson	Codice 305620
Isoflurano	Blutler Schein	Codice: 50562
Ketoprofene	Fort Dodge Salute degli animali
Forbici chirurgiche, maionese dritta da 5,5 pollici	Henry Schein	22-1600
Linea cellulare PANC-1 GFP	Anticancro, Inc
Sistema di imaging per piccoli animali: iBox Scientia	UVP, LLC. Upland, CA.		Small Animal Imaging System per osservare il tumore fluorescente in animali vivi
SutureVet PGA 6-0 PGA	Henry Schein	Telefono 39010
Linea cellulare PANC-1 GFP	Anticancro, Inc
DPBS (soluzione salina tamponata con fosfato di Dubelcco)	Thermo Ficher Sci	21300025