Isolamento delle cellule staminali PDAC: un metodo per isolare le cellule staminali tumorali dai tumori del pancreas

Abstract

Fonte: Lonardo, E., et al. Studiare le caratteristiche delle cellule staminali del cancro al pancreas per sviluppare nuove strategie di trattamento. J. Vis. Exp. (2015).

Questo articolo descrive la tecnica per isolare le cellule staminali del cancro del pancreas (CSC) dal tessuto dell'adenocarcinoma duttale pancreatico umano (PDAC). Queste CSC sono utilizzate per studiare gli effetti funzionali del trattamento farmacologico sulla capacità di auto-rinnovamento in vitro delle CSC per lo sviluppo di trattamenti antitumorali più efficienti.

Protocollo

1. Isolamento delle CSC dal PDAC umano (Figura 1)

1. In una cappa di biosicurezza sterile, trasferire il tessuto PDAC umano in una piastra di coltura di 60 x 15 mm contenente 1 ml di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato 1X (PBS). Tritare il tumore in piccoli pezzi (1 - 5 mm) utilizzando un bisturi sterile e una pinza.
2. Aggiungere 1 ml di 1X PBS sterile alla piastra di coltura e ripetere la fase di triturazione fino a quando il tessuto non è completamente dissociato, questo richiede regolarmente 3-4 cicli. Trasferire la sospensione tissutale (rabboccare fino a un volume finale di 5 ml con 1X PBS) in una provetta sterile e omogeneizzarla meccanicamente con un dissociatore come gentleMACS.
3. Incubare il tessuto omogeneizzato con collagenasi (utilizzare 2,5 mg/ml di collagenasi in 1X PBS) per 60 minuti a 37°C e quindi centrifugare per 5 minuti a 900 x g. Decantare il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 10 ml di terreno completo. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino da 40 μm e centrifugare per 5 minuti a 900 x g.
4. Decantare il surnatante e risospendere il pellet con 5 ml di tampone di lisi dei globuli rossi (ammonio-cloruro-potassio, ACK) e incubare il
5. Risospendere il pellet in terreno CSC, impiattare su un piatto ricoperto di gelatina e incubare a 37°C per 1 ora. Questo passaggio rimuoverà la maggior parte delle cellule dei fibroblasti che si attaccano rapidamente alla piastra.
6. Rimuovere la piastra dall'incubatore e recuperare con cura la sospensione cellulare e quantificare il numero di cellule vitali (tripano blu-negativo) utilizzando un emocitometro. A tale scopo, miscelare delicatamente la sospensione e pipettare 20 μl di sospensione in una provetta Eppendorf. Aggiungere 20 μl (rapporto 1:1) di blu di tripano alle cellule della provetta per microcentrifuga e mescolare bene. Pipettare circa 10 μl della miscela sull'emocitometro.
7. Contare tutte le cellule libere all'interno dei quattro quadranti angolari della camera di conteggio per la conta delle cellule vitali.
   nota: La vitalità e la resa delle cellule possono variare considerevolmente tra i campioni tumorali. Per i campioni di PDAC, la vitalità varia regolarmente tra il 45 e il 70% e i pezzi di tessuto di un campione tumorale macroscopico con un diametro di 3 - 5 mm dovrebbero cedere a circa 5x10⁶ cellule vitali.

Risultati

Figura 1. La metformina si rivolge selettivamente alle CSC.
(A) La metformina ha diminuito le dimensioni delle sfere. Immagini rappresentative delle sfere ottenute dopo il trattamento con le dosi indicate di metformina per 7 giorni (pannello di destra). Quantificazione della dimensione della sfera (n≥6) (pannello di sinistra), i numeri indicati nell'asse delle a...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Camera di conteggio/ Emocitometro	Hausser Scientific Co	3200
Contatore e analizzatore di cellule CASY per la misurazione della proliferazione e della vitalità	Roche Innovatis	AG CASY Modello TTC 45,60,150 μm
Dissociatore GentleMACS	Miltenyi Co	130-093-235
Tubi GentleMACS C	Miltenyi Co	Codice 130-093-237
Piastre per coltura tissutale da 100 mm	Falco BD	353803
Filtro cellulare	Falco BD	Codice 352350
Tubo conico in polipropilene da 15 ml	Falco BD	352097
Tubo conico in polipropilene da 50 ml	Falco BD	Codice 352070
Provette sterili da 1,5 ml	Eppendorf	Codice 0030 120.086
Provette da centrifuga da 50 ml	Corning	430828
Piastre di Petri sterili, piastre da 10 cm	Corning	353003
Collagenasi tipo IV	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 7909
RPMI medio 1640	Tecnologie di vita	Codice 11875-085
Soluzione di penicillina/streptomicina, 100X	Tecnologie di vita	SV30010
L-glutammina, 200 mM, 100X	Tecnologie di vita	Codice 25030-081
Integratore B27 50x	Tecnologie di vita	Codice 17504-044
Fattore di crescita di base dei fibroblasti	sigma	F0291
Aquila modificata di Dulbecco Medium/F12	sigma	D8437
Sterile 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	sigma	D8537
Tripan Blu	Tecnologie di vita	Codice 15250-061
Incubatore con ingresso di CO2
Micro forbici
Pinze curve
Pinze per schegge