Saggio di formazione di sfere: un metodo in vitro per identificare le cellule staminali del cancro del pancreas e le terapie di screening

In questo articolo

Abstract

Fonte: Lonardo, E. et al. Studiare le caratteristiche delle cellule staminali del cancro al pancreas per sviluppare nuove strategie di trattamento. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video dimostra il protocollo per lo sviluppo di sferoidi di cellule staminali per il cancro del pancreas in vitro. Il test può servire come strumento di screening per identificare i composti che potenzialmente colpiscono le cellule staminali tumorali.

Protocollo

1.Saggio e analisi della formazione della sfera

Saggio di formazione delle sfere e trattamento con metformina
1. Prendere il numero richiesto di cellule e aggiungere il volume appropriato di terreno CSCs per preparare una concentrazione cellulare di 2.000 cellule/ml. Non tenere la sospensione cellulare in ghiaccio per non più di 1 ora e mescolare bene prima della placcatura.
2. Aggiungere 500 μl di PBS 1X alla prima e all'ultima fila di una piastra a 24 pozzetti per l'umidificazione per ridurre al minimo l'evaporazione del mezzo. Seminare le cellule in piastre di cellule a bassissimo attaccamento a una densità di 2.000 cellule per pozzetto in 1 ml di terreno della sfera tumorale (2.000 cellule/ml).
  nota: Il numero di cellule utilizzate per i saggi di formazione della sfera tumorale può variare tra i tipi di tumore.
3. Trattare almeno 4 pozzetti con veicolo (controllo negativo) e 4 pozzetti con ogni trattamento assegnato, ad es. 3 mM di metformina. Mettere le cellule in un incubatore impostato a 37 °C e fornire alle cellule il 5% di CO₂ per una settimana.
  nota: Il terreno non deve essere cambiato per consentire la formazione indisturbata delle sfere tumorali, ma può essere ricaricato con fattori di crescita su base giornaliera poiché non sono stabili nel terreno di coltura.
4. A giorni alterni aggiungere un trattamento, ad esempio 3 mM di metformina o veicolo a ciascuno dei pozzetti. Valutare il numero di sfere tumorali formate dopo 5 e/o 7 giorni mediante l'uso di un contatore di cellule automatizzato che consente il conteggio di strutture più grandi (Figura 1).
  nota: Dovrebbero essere prese in considerazione solo le sfere tumorali con almeno 40 μm e possono essere classificate rispettivamente come piccole (40 - 80 μm) o grandi (80 - 120 μm). I risultati possono essere illustrati come la percentuale di sfere tumorali divisa per il numero iniziale di cellule seminate (ad esempio, 2.000 cellule).
Passaggio seriale di sfere tumorali di prima generazione
1. Dopo 7 giorni di incubazione, raccogliere le sfere tumorali utilizzando un colino cellulare da 40 μm e centrifugarle per 5 minuti a 900 x g a RT.
2. Dissociare il pellet delle sfere tumorali in singole cellule utilizzando la tripsina, quindi espandere nuovamente la sospensione di singole cellule ottenuta per altri 7 giorni.

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Risultati

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Figura 1. Il trattamento con metformina inibisce il consumo di ossigeno e induce la produzione di ROS. (A) L'aggiunta di metformina inibisce il consumo di ossigeno (OCR) delle cellule derivate da sfere. Due diverse sfere secondarie di PDAC sono state trattate con metformina e le variazioni dell'OCR sono state misurate mediante analisi del flusso extracellulare. L'in...