Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Risonanza magnetica
- Applicare la risonanza magnetica quando le dimensioni del tumore sono di circa 5-7 mm di diametro di solito 2~4 settimane dopo l'impianto delle cellule. Utilizza uno scanner RM dedicato all'imaging di piccoli animali o uno scanner RM clinico dotato di una bobina specializzata per l'imaging di piccoli animali.
nota: Abbiamo utilizzato uno scanner RM per piccoli animali da 9,4 T con una combinazione di un risonatore/trasmettitore di volume 1H e un ricevitore a bobina di superficie (30 mm di diametro) (Bruker BioSpin Corp., Billerica, MA). Una bobina di superficie fornisce un migliore rapporto segnale/rumore (SNR).
- Preparare un mezzo di contrasto per risonanza magnetica a base di gadolinio per iniettare ~0,1 - 0,2 mmol/kg a ciascun animale in ~0,1 - 0,2 ml di PBS (soluzione salina tamponata con fosfato).
nota: Abbiamo usato gadoteridolo e iniettato 0,2 mmol/kg in 0,15 ml di PBS per un periodo di 15 secondi (0,1 ml/sec).
- Preparare una provetta in micro-polietilene (lunghezza: 7,62 mm, diametro interno: 0,28 mm, diametro esterno: 0,64 mm). Inserire un ago da 30 G (lunghezza 12,7 mm) in un'estremità del tubo e un ago a punta smussata da 30 G (lunghezza 9,5 mm) nell'altra estremità. Collegare una siringa da 1 ml contenente il mezzo di contrasto per la risonanza magnetica all'ago con punta smussata e spingere lentamente la siringa per riempire l'intero tubo con il mezzo di contrasto per la risonanza magnetica.
- Anestetizzare gli animali utilizzando la ventilazione con ~1 - 2% di isoflurano miscelato con ossigeno (2 L/min) durante la preparazione e l'imaging. Confermare la profondità dell'anestesia con il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi. Applicare un unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Dilatare la vena caudale utilizzando una lampada termica prima dell'inserimento dell'ago. Afferra il centro dell'ago da 30 G usando la pinza Kelly e inseriscilo nella vena della coda. Fissa sia la coda che il tubo su un pezzo di carta di plastica o cartone (10 mm di larghezza x 100 mm di lunghezza) per mantenere la coda dritta.
- Posizionare l'animale in posizione supina in una cuccia dotata di acqua calda circolante (o aria calda) per regolare la temperatura corporea durante l'imaging. Impostare la temperatura sul letto a 37 °C. Inserire una sonda di temperatura rettale per monitorare la temperatura corporea durante l'imaging.
- Applicare una tavola di plastica piegata ortogonalmente nella zona addominale. Assicurarsi che il tumore si trovi dietro l'estremità superiore della tavola, quindi tirare leggermente verso il basso la tavola (~2 mm) per assicurarsi che il tumore venga catturato dalla tavola. Fissa saldamente la tavola al letto dell'animale.
- Fissare con nastro adesivo un trasduttore per la respirazione (SA Instrument, Inc., Stony Brook, NY) sull'area del torace per monitorare la respirazione degli animali durante l'imaging. Posiziona una bobina di superficie sulla parte superiore della regione tumorale e fissala saldamente al letto dell'animale. Spingere la cuccia nell'apparecchio per la risonanza magnetica per posizionare la regione tumorale al centro della bobina volumetrica (diametro interno: 72 mm).
- Eseguire l'abbinamento e la sintonizzazione sia per il ricevitore che per il trasmettitore, seguiti dallo spessoramento.
- Inizia con una sequenza RM anatomica per localizzare il tumore. Utilizzare una sequenza spin-echo turbo pesata in T2 (T2W) per ottenere immagini assiali con i seguenti parametri di acquisizione. Tempo di ripetizione (TR)/tempo di eco (TE) = 3.000/34 msec, matrice 128 x 128, campo visivo 30 x 30 mm, numero di medie = 1, lunghezza del treno di eco = 4 e 20 fette contigue di 1 mm di spessore in modalità interlacciata per coprire l'intera regione tumorale (tempo di scansione totale: 1,6 min).
nota: Poiché i tumori pancreatici ortotopici sono più difficili da localizzare rispetto a quelli sottocutanei, le immagini con localizzatore convenzionale con una risoluzione inferiore potrebbero non essere utili.
- Acquisisci immagini ponderate T1 (T1W) con vari angoli di capovolgimento per recuperare la mappa T1. A tale scopo, utilizzare un approccio ad angolo di eco a gradiente multiplo con i seguenti parametri: tempo di ripetizione (TR)/tempo di eco (TE) = 115/3 msec, matrice 128 x 128, campo visivo di 30 x 30 mm, numero di medie = 4, ~5 - 7 fette contigue di 1 mm di spessore in modalità interlacciata per coprire la regione tumorale e sette angoli di inversione di 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 70 (tempo di scansione totale per angolo di rotazione: 1 min).
nota: Tuttavia, l'approccio multi-angolo di inversione è efficiente solo quando l'omogeneità del campo B1 è elevata. In caso contrario, le mappe T1 possono essere ottenute con l'approccio TR multiplo.
- Acquisizione di immagini T1W prima e dopo l'iniezione di mezzo di contrasto RM a base di gadolinio. Utilizza gli stessi parametri di acquisizione e la stessa geometria per la mappatura T1 ma con l'angolo di inversione fisso di 30. Utilizzare la codifica lineare per garantire lo stato stazionario quando si ottiene il centro dello spazio k, specialmente quando si utilizza un TR corto e un angolo di inversione di grado basso. Acquisire 5 immagini di base prima dell'iniezione di contrasto. Quindi acquisire 40 immagini dopo l'iniezione di contrasto (tempo di scansione totale: 45 min). Utilizzare una pompa a siringa per iniettare il mezzo di contrasto a una velocità costante (0,01 ml/sec).
- Monitorare continuamente la respirazione degli animali e regolare la concentrazione di isoflurano per mantenere la frequenza respiratoria a 50-100 respiri al minuto. Monitorare la temperatura corporea degli animali durante l'imaging.
- Dopo aver completato la DCE-MRI, togliete l'ago e le altre sonde e mettete l'animale in una gabbia vuota con carta assorbente. Massaggiate delicatamente la zona addominale inferiore. La gabbia deve essere posizionata per metà sotto una lampada termica per consentire all'animale di muoversi dentro e fuori dal gradiente di calore mentre si riprende. Non lasciate un animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
