1. Preparazione di sferoidi tumorali 3D incorporati nell'ECM
- Preparare una stazione di lavoro con i materiali necessari all'interno di una cappa a flusso laminare.
- Preparare una miscela diluita di sonde traccianti fluorescenti da 1 μm di diametro modificate con carbossilato aggiungendo 2 parti di sonde stock (2% di solidi) a 25 parti di acqua sterile.
- Estrarre un flacone di 3,1 mg/ml di collagene bovino dal frigorifero e metterlo sul ghiaccio.
- Aliquotare 125 μl di collagene in un flaconcino vuoto da 2 ml.
- Aggiungere 50 μl di soluzione diluita della sonda tracciante alla fiala contenente il collagene e agitare brevemente per distribuire le sonde.
- Aggiungere 235 μl di terreno di coltura cellulare appropriato contenente rosso fenolo (che diventerà giallo) per un volume totale di 410 ml e agitare brevemente prima di rimuovere 205 ml (metà del volume totale) e metterli in un nuovo flaconcino da 2 ml. La fiala 1 conterrà lo sferoide tumorale e la fiala 2 sarà una miscela di controllo.
- Aggiungere ~2 μl di 1 M di NaOH al flaconcino 1 per riportare la soluzione a pH neutro (i terreni di coltura contenenti rosso fenolo devono tornare al rosso). Si noti che questo farà sì che la miscela inizi a polimerizzare se non viene tenuta in ghiaccio. Agitare brevemente per mescolare, quindi tornare immediatamente alla griglia del ghiaccio.
nota: Lo sferoide è appena visibile ad occhio nudo dopo 9 giorni di coltura e la sua rimozione dal letto di agarosio è un compito delicato. L'uso di un microscopio da dissezione può essere utile per alcuni utenti. Mantenere l'integrità dello sferoide durante il trasferimento è fondamentale.
- Utilizzando un puntale per pipetta a bocca larga, rimuovere delicatamente 40 μl di terreno dal pozzetto contenente lo sferoide tumorale. Conservare questi 40 μl durante l'esecuzione del passaggio successivo.
- Controlla il pozzo per vedere se lo sferoide è stato rimosso nel passaggio precedente. In caso affermativo, aggiungere i 40 μl contenenti lo sferoide al flaconcino 1. In caso contrario, riposizionare i 40 μl nel pozzetto e ripetere il passaggio precedente.
- Agitare delicatamente la fiala 1 (non rischiare di formare vortici, potrebbe danneggiare lo sferoide) prima di trasferire la miscela in porzioni da 60 μl in tre pozzetti separati di una piastra da 96 pozzetti. Ispezionare ogni pozzetto con un microscopio dopo aver aggiunto la miscela per determinare quale pozzetto contiene lo sferoide.
- Aggiungere ~2 μl di NaOH da 1 M e 40 μl di terreno di coltura cellulare alla fiala 2 e agitare prima di aliquotare 60 μl di questa miscela in un pozzetto vuoto nella piastra a 96 pozzetti ed etichettare come controllo.
- Porre la piastra in un'incubatrice a 37 °C per indurire per almeno 1 ora.
2. Costruisci una griglia di punti campione e fai un video in ogni punto
- Trasferire la piastra del campione dall'incubatore al tavolino del microscopio. Attendere 10 minuti affinché il campione si equilibri con la temperatura ambiente se non è disponibile un tavolino riscaldato.
- Osservare il campione con lenti dell'obiettivo a bassa potenza per assicurarsi che sia intatto e pronto per l'imaging. Determinare la posizione del tumore all'interno del pozzetto.
- Decidi quanti punti campione prendere. Tipicamente, 20 punti di campionamento in ciascun pozzetto, distribuiti in anelli concentrici attorno allo sferoide, produrranno risultati adeguatamente dettagliati.
- Spostare il tavolino in ciascuna posizione desiderata e utilizzare il software di interfacciamento del microscopio per registrare le coordinate x e y (o registrare le coordinate manualmente se il software di interfacciamento non è disponibile).
- Passare il microscopio a una lente dell'obiettivo ad alta potenza (in genere 100X) e selezionare il cubo del filtro appropriato per la lunghezza d'onda di eccitazione delle sonde traccianti. Utilizzare l'elenco di punti creato nel passaggio 2.4 per passare al primo punto della griglia.
- Regola la messa a fuoco per trovare il fondo del pozzo, quindi spostati verso l'alto per trovare un campo visivo (fov) contenente diverse sonde traccianti a fuoco.
- Osservare l'istogramma dell'intensità e regolare l'intensità e il tempo di esposizione per ottenere la massima gamma dinamica possibile, assicurandosi che l'immagine non si saturi.
- Ottenere una sequenza video a una frequenza di fotogrammi di 20-30 msec per fotogramma (si consigliano circa 800 fotogrammi o 16-24 secondi di lunghezza per fornire statistiche sufficienti per un calcolo MSD affidabile bilanciato con la necessità di ridurre al minimo il tempo di acquisizione in ogni punto della griglia spaziale) e salvare con una convenzione appropriata. Durante la registrazione, non toccare il microscopio o il tavolo.
- Ripetere i passaggi da 2.6 a 2.9 per ogni punto di campionamento nella griglia.
- Ripetere i passaggi da 2.3 a 2.10 per ogni pozzetto dell'esperimento.
