Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Trasduzione di linee cellulari di cancro al pancreas
- Trasdurre le cellule tumorali del pancreas per esprimere la luciferasi come descritto in precedenza. Qui vengono utilizzate linee cellulari di cancro al pancreas Panc-1 e Capan-1 trasdotte con luciferasi lucciola.
Nota: può essere utilizzata anche la luciferasi renilla o la luciferasi batterica.
2. Preparazione delle cellule di cancro al pancreas
- La coltura ha trasdotto le cellule tumorali del pancreas fino al 70% confluenti.
- Sollevare le cellule pancreatiche e garantire che la vitalità sia superiore al 90%.
- Risospendere a 2 x 107 cellule/ml in una miscela 3:2 di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) Matrigel:Phosphate refrigerata.
- Mantenere la sospensione di Matrigel-cell in ghiaccio prima dell'iniezione nel pancreas.
NOTA: Per garantire una rapida solidificazione di Matrigel, ridurre il volume del PBS per tenere conto del volume del pellet della cella. Maneggiare sempre Matrigel con strumenti ghiacciati e siringhe per prevenire la solidificazione prima dell'iniezione. Il numero di cellule suggerito è una guida e dovrebbe essere determinato empiricamente per ogni linea cellulare.
3. Preparazione del mouse
- Anestetizzare il topo utilizzando isoflurano al 2-3% inalato. Determinare la profondità dell'anestesia in base alla mancanza di riflesso del pedale fino a un leggero pizzicamento delle dita.
- Applicare lubrificante sugli occhi per prevenire l'essiccazione.
- Posizionare il mouse sul retro su un termoforo a 37 °C e ruotare delicatamente il mouse per sollevare il lato sinistro dell'addome.
- Preparare l'addome con una soluzione di iodio povidone al 10%.
NOTA: L'anestesia iniettabile può essere utilizzata al posto dell'anestesia inalatoria. Il digiuno preoperatorio non è necessario.
4. Laparotomia
- Utilizzando strumenti chirurgici sterili, praticare un'incisione di 1,5 cm nella pelle a circa 1 cm a sinistra laterale dalla linea mediana.
- Praticare un'incisione di 1,5 cm nel muscolo addominale sottostante.
- Localizzare la milza usando la pinza e rimuovere delicatamente la milza dalla cavità addominale. Fissare la milza lungo un batuffolo di cotone sterile per esporre il pancreas sottostante.
- Individua la coda del pancreas adiacente alla milza.
- Utilizzando una siringa da insulina da 29 G 0,3 ml, iniettare 20 μl della sospensione di cellule Matrigel nel pancreas.
- Dopo l'iniezione, tenere la siringa nel pancreas per 30-60 secondi fino a quando il Matrigel non si è solidificato. Questo importante passaggio riduce al minimo le perdite cellulari.
- Ispezionare il sito di iniezione per assicurarsi che non si siano verificate perdite.
- Riportare la milza e il pancreas nella cavità addominale.
NOTA: Fare attenzione a non perforare il lato dorsale del pancreas che potrebbe essere sottile.
5. Chiusura della parete addominale
- Chiudere la muscolatura addominale del topo con una sutura intrecciata 4-0 riassorbibile con un ago rotondo utilizzando un punto continuo.
- Chiudere la pelle esterna con una sutura monofilamento 6-0 non assorbibile con un ago da taglio utilizzando un punto continuo.
- Rimuovere il topo dall'anestetico inalato e iniettare 0,05-0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea.
- Lasciare che il mouse si riprenda nella sua gabbia posizionata su un termoforo a 37 °C con libero accesso a cibo e acqua. Se i topi mostrano segni di dolore come curvatura o mobilità ridotta, la buprenorfina può essere somministrata ogni 12 ore per un periodo di 36 ore.
- Dopo la guarigione della ferita (7-10 giorni), anestetizzare il topo e rimuovere i punti di sutura esterni.
6. Monitoraggio bioluminescente della progressione del cancro al pancreas
- Anestetizzare il topo con isoflurano per via inalatoria.
- Iniettare 150 mg/kg di D-luciferina attraverso la vena caudale.
- Posiziona il mouse nel sistema di imaging bioluminescente e acquisisci immagini a luce bianca e bioluminescenza.
- Togliete il topo dall'anestetico inalato e lasciatelo riprendersi nella sua gabbia domestica.
NOTA: L'imaging bioluminescente non è invasivo e può essere condotto periodicamente per studiare la cinetica di crescita del tumore. Per visualizzare il tumore nella coda del pancreas, è importante posizionare il mouse sul lato sinistro, in modo che il tumore punti verso la telecamera. Abbiamo ripreso una volta alla settimana con la frequenza aumentata fino a tre volte alla settimana prima dell'endpoint sperimentale utilizzando un sistema di imaging Lumina II (Perkin-Elmer, ex Caliper Life Sciences) che esegue il software Living Imaging 4.3.1 con binning 4, FOV 12,5, F-stop 1, esposizione 1 - 60 sec (determinata dall'esposizione più alta senza saturazione dei pixel).
