Preparazione del blocco di tessuto cutaneo congelato: un protocollo per conservare campioni di melanoma cutaneo dalla pelle dorsale murina

Abstract

Fonte: Moon, H., et al. Controllo spaziale e temporale dell'inizio del melanoma murino da cellule staminali di melanociti mutanti. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video descrive il protocollo dettagliato per isolare la pelle dorsale murina contenente melanoma, seguito da crio-embedding per preparare un blocco di tessuto cutaneo congelato. Il blocco di tessuto crio-incorporato può essere sezionato ed esaminato al microscopio per studiare la progressione del melanoma.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Lavorazione dei tessuti

1. Isolamento cutaneo
   1. Prima di iniziare, procurati quanto segue: strumenti per necroscopia, carta da filtro e tovaglioli di carta.
   2. Sopprimere i topi secondo i protocolli approvati e confermare la morte prima di procedere.
   3. Usando un tagliacapelli, radere i peli dalla zona della pelle dorsale. Spazzolare leggermente l'area con un fazzoletto privo di lanugine per liberare l'area.
   4. Fai una piccola incisione con le forbici affilate appena sopra la base della coda.
   5. Inserire grandi forbici smussate nell'incisione e separare i tessuti connettivi sottocutanei.
   6. Isolare con cura la regione della pelle di interesse tagliando con forbici affilate lungo il bordo del tessuto.
   7. Posiziona il fazzoletto cutaneo su un tovagliolo di carta pulito e usa una pinza opaca per allungare la pelle in modo che aderisca all'asciugamano e sia tesa. Questo passaggio serve a fornire un supporto aggiuntivo per il tessuto in modo che possa essere manipolato e lavorato mantenendo la sua forma.
      nota: Fare attenzione a maneggiare solo le regioni esterne del tessuto cutaneo, poiché il forcipe può causare danni alla pelle che possono essere visti istologicamente.
2. Fissazione tissutale
   1. Piega un pezzo di carta da filtro a metà ed etichetta in modo appropriato. Posizionare la pelle insieme al supporto di carta assorbente nella carta piegata immediatamente adiacente alla piega, assicurandosi che il campione sia liscio e non piegato o accartocciato. Sigillare la carta da filtro pinzando i lati aperti, quindi rifilare in modo che la carta rimanente possa essere utilizzata per campioni futuri.
      nota: Questo passaggio viene eseguito in modo che la pelle mantenga la sua forma durante la fissazione.
   2. Immergere completamente il campione di tessuto in formalina tamponata neutra al 10% per 3-5 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
   3. Dopo la fissazione, rimuovere i campioni dalla formalina, lavarli in acqua deionizzata (2x 5 min ciascuno) e procedere alla realizzazione di blocchi di tessuto. Rimuovere con cura qualsiasi residuo di materiale dal tessuto cutaneo (ad esempio, residui di carta).
3. Realizzazione di blocchi di tessuto congelati (Figura 1)
   1. Taglia i bordi del campione di pelle in modo che non siano frastagliati e poi fai 3 tagli sagittali. La larghezza di queste strisce non deve essere superiore all'altezza del criomold (5 mm). Successivamente, eseguire tagli trasversali in modo che i pezzi di pelle non siano più lunghi della larghezza del criomold (20 mm) e possano essere incorporati. Ripetere con la restante metà della pelle dorsale, o conservare il tessuto per altri usi (alternativamente, conservare metà prima della fissazione).
      nota: È importante mantenere i pezzi di pelle nel corretto orientamento.
   2. Orientare il criomold (25 x 20 x 5 mm³) in orientamento verticale e posizionare da 4 a 5 pezzi di pelle sopra l'OCT. Una volta che tutti i pezzi sono a posto, usa 2 paia di pinze sottili per portare il bordo lungo della pelle sul fondo del criostampo. La pelle dovrebbe ora essere in piedi nell'OCT perpendicolare alla base dello stampo. Fare attenzione a ridurre al minimo la formazione di sacche d'aria all'interno dell'OCT durante questa fase (Figura 1).
   3. Riempi lo stampo con OCT fino al secondo labbro e posizionalo sulla superficie piana del ghiaccio secco. Usa le pinze per regolare eventuali pezzi di pelle che potrebbero essersi spostati durante il trasferimento quando il blocco inizia a congelarsi. Una volta che lo strato inferiore si è solidificato, la manipolazione dei tessuti sarà impossibile.
   4. Taglio di vetrini da 8-10 μm per l'analisi.
4. Produzione di blocchi di tessuto FFPE (Formalina Fixed Paraffin Embedded)
   1. Mettere 2 pezzi di pelle fissa in una cassetta etichettata e disidratare in concentrazioni crescenti di etanolo (75% di etanolo per 30 minuti, 85% per 30 minuti, 90% per 30 minuti, 95% per 30 minuti, 100% per 2x 30 minuti, xilene o sostituto dello xilene per 2x 30 minuti). Incubare con paraffina a 58-60°C, prima per 30 minuti e poi per tutta la notte.
   2. Incorporare il fazzoletto in uno stampo in acciaio inox²⁴ x 24 mm con paraffina liquida e solidificare a -5 °C. L'orientamento del tessuto dovrebbe essere simile a quello dei blocchi di tessuto congelati in modo da poter visualizzare le sezioni longitudinali su più follicoli piliferi (Figura 1).
   3. Una volta che la paraffina si è solidificata, rimuovere lo stampo e tagliarlo in sezioni di 5-10 μm per l'analisi.

Risultati

Figura 1: Isolamento del tessuto cutaneo e crio-inclusione. Dopo l'eutanasia, radere la regione dorsale della pelle del topo di interesse e incorporare la pelle nel criomold contenente OCT. La linea tratteggiata sul mouse rappresenta la linea mediana. Tipicamente, 3 o 4 pezzi di pelle possono essere isolati con il segmento di linea 3-4 lungo la linea mediana; Uno di questi pezzi è indicato da un rett...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Rifinitore per peli di animali domestici	Wahl	Codice 09990-502
Crema depilatoria	Nair	n/a	Disponibile nella maggior parte delle farmacie
Tamponi di cotone	diverso
Lampadina a raggi ultravioletti	UVP	95-0042-08	modello XX-15M lampada UV di fascia media
Etanolo a 200 gradi	diverso		etanolo puro
Histoplast PE	Fisher Scientifico	22900700	pellet di paraffina
Formalina tamponata neutra, 10%	sigma	HT501128-4L
Composto O.C.T.	termo	23730571
Cassetta per fazzoletti	Sakura	Codice 89199-430	per lavorazione FFPE
Criostampi	Sakura	Numero 4557	25 x 20 millimetri
Stampo in metallo FFPE	Leica	3803082	24 mm x 24 mm
Isoflurano	diverso		Grado veterinario
Sistema di inalazione per anestesia	diverso		Grado veterinario
Forbice fine	FST	Codice 14085-09	Dritto, affilato/affilato
Forbice fine	FST	Codice: 14558-09	Dritto, affilato/affilato
Pinza	FST	Codice 11252-00	Dumont #5
Pinza	FST	Codice: 11018-12	Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten f/f	Laboratori Jackson	Codice: 13590
LSL-tdPomodoro	Laboratori Jackson	Codice: 7914	ai14