Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Trattamento del tessuto tumorale per l'impianto del topo
- Escissione chirurgica o processamento chirurgico dei tessuti per biopsia
- Trasferire il tessuto in una capsula di Petri sterile e separare il più possibile il tessuto tumorale dal tessuto normale circostante.
- Rimuovere il più possibile il tessuto necrotico (solitamente identificato come tessuto biancastro pallido situato centralmente all'interno del tumore) dal tumore rimanente.
- Utilizzare un bisturi per suddividere un pezzo iniziale di tumore in pezzi approssimativamente uguali (~3 mm x 3 mm) per l'impianto chirurgico di topo (Figura 1).
- Facoltativamente, se è disponibile una quantità sufficiente di tessuto tumorale, congelare il tessuto per i saggi a valle (sequenziamento dell'RNA [RNASeq], sequenziamento dell'intero esoma [WES], ecc.).
- Prepara un impasto tumorale tritando il tessuto tumorale usando una tecnica a lama incrociata con due lame di bisturi. Tritare i pezzi di tumore il più finemente possibile per formare un impasto, che ora è pronto per l'impianto chirurgico di topo.
- In alternativa, se il tessuto tumorale è troppo duro per la dissociazione meccanica, utilizzare una procedura di dissociazione della digestione per formare un impasto gelatinoso e una sospensione unicellulare per l'impianto e/o l'iniezione.
- Tritare i pezzi di tumore il più finemente possibile per formare un impasto.
- Mettere l'impasto in una provetta da 50 mL con soluzione salinosa bilanciata di Hank fredda (HBSS)-/- (senza Ca++ e Mg++); quindi, centrifugare il pellet a 220 x g per 4 min a 4 °C.
- Risospendere l'impasto in 10 mL di terreno di digestione fresco riscaldato (200 U/mL di collagenasi EV + 5 mM di CaCl2 + 50 U/mL di DNasi in HBSS-/-) per 1 g di tessuto tumorale.
- Mettere la provetta in un bagnomaria a 37 °C per 20 minuti e mescolare energicamente ogni 5 minuti con una pipetta monouso.
- Lavare con un massimo di 50 ml di HBSS-/-; quindi, centrifugare a 220 x g per 4 minuti a 4 °C.
- Aggiungere 5 mL di TEG preriscaldato (0,025% tripsina + 40 μg/mL di glicole etilenico-bis(β-amminoetil etere)-N,N,N',N'-tetraacetico [EGTA] + 10 μg/mL di alcol polivinilico [PVA]) per 1 g di tessuto tumorale, risospendere/agitare delicatamente e posizionare la provetta a 37 °C per 2 minuti senza mescolare.
- Aggiungere almeno 1 volume uguale di terreno di colorazione a freddo (1% di albumina sierica bovina [BSA] + 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico [HEPES] + 1x penicillina-streptomicina in terreno L15) per estinguere la tripsina e centrifugare a 220 x g per 4 minuti a 4 °C.
- Risospendere il campione in 10 mL di terreno di colorazione per 1 g di tessuto tumorale e filtrarlo attraverso un filtro cellulare da 40 μm per ottenere una sospensione di una singola cellula per l'iniezione nel topo (Figura 1).
- Il liquame rimasto sopra il filtro cellulare può essere raccolto anche per l'impianto chirurgico del topo.
- Impianto e iniezione di tumore nei topi
- Impianto di escissione chirurgica o di tessuto bioptico chirurgico
nota: Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano sterili mediante sterilizzazione in autoclave o con l'uso di strumenti monouso pre-sterilizzati.
- Radere i peli dalla parte bassa della schiena di topi maschi o femmine NSG 6-8 settimane lasciando un'area di circa 1,5 cm x 3 cm senza peli. Anestetizzare i topi usando isoflurano e confermare stringendo delicatamente il piede come test di reattività. Usa un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza.
- Posizionare i singoli topi su un cuscinetto termico nel cono nasale della macchina per anestesia, strofinare l'area rasata con clorexidina. Quindi, bagnare con etanolo al 70% e lasciarlo evaporare.
- Preparare pezzi o dividere l'impasto tumorale in una capsula di Petri in singoli tumuli per l'impianto chirurgico (cioè, in tre tumuli uguali se da impiantare in 3 topi).
- Utilizzando la lama del bisturi, praticare un'incisione di circa 5 mm di lunghezza al centro della parte posteriore del mouse, prelevare un paio di pinze e sollevare la pelle sul lato dell'incisione opposto all'operatore.
- Prendi le forbici nell'altra mano e separa la pelle dallo strato muscolare tagliando delicatamente la membrana fasciale con piccoli tagli a forbice, creando così una "tasca" per il tessuto tumorale.
- Raccogli un pezzo di tumore o un singolo cumulo di tessuto tumorale con la lama del bisturi e posiziona delicatamente il tessuto nella tasca creata.
- Somministrare 100 μL di matrice extracellulare artificiale sul tumulo di tessuto tumorale nella tasca.
- Usando due paia di pinze, tirare verso l'alto l'incisione su entrambe le estremità in modo che i bordi della ferita si avvicinino e chiudere la ferita applicando una o due clip per ferite.
- Iniettare per via sottocutanea 1-5 mg/kg di meloxicam come analgesico nei topi dopo l'intervento chirurgico.
- Togliete il topo dal cono del naso e rimettetelo nella sua gabbia originale; osservate il topo mentre si sveglia. Non tornare in una gabbia fino a quando non si è completamente ripreso.
- Rimuovere le clip della ferita dopo circa 7 giorni. Se la guarigione non è completa dopo 7 giorni, lasciare la clip della ferita per altri uno o due giorni.
nota: Se si utilizza una sospensione di una singola cellula dall'escissione chirurgica o dal trattamento del tessuto bioptico chirurgico, si mescolerà con la matrice extracellulare artificiale (in rapporto 1:1) per l'iniezione nei topi.
- Iniezione di FNA o tessuto bioptico centrale
- Posizionare un mouse NSG su una griglia di acciaio, tenere saldamente il mouse per la coda e tirare delicatamente indietro il mouse. Afferrerà saldamente la griglia con le zampe anteriori. In alternativa, trattieni il mouse nella mano non dominante e lascia visibile l'area del fianco.
- Disinfettare la pelle del fianco con tamponi imbevuti di alcol. Iniettare lentamente e costantemente il contenuto della siringa sotto la pelle del topo.
- Estrarre l'ago e riposizionare il mouse nella sua gabbia.
- Monitorare la crescita del tumore
- Monitorare i topi una volta alla settimana per verificare la presenza di tumori palpabili.
- Una volta che i tumori hanno raggiunto una dimensione misurabile (circa 50 mm3), utilizzare un calibro per registrare le dimensioni del tumore. Utilizzare la seguente formula per calcolare i volumi tumorali: (larghezza x larghezza x lunghezza) / 2.
- Raccogliere il tumore una volta che il volume del tumore raggiunge circa 1,5 cm3 (circa 4-10 settimane). Il tumore è ora chiamato passaggio del topo 1 (MP1).
