Modellazione di xenotrapianti derivati da pazienti: una tecnica per generare modelli murini di melanoma

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Trattamento del tessuto tumorale per l'impianto del topo

1. Escissione chirurgica o processamento chirurgico dei tessuti per biopsia
   1. Trasferire il tessuto in una capsula di Petri sterile e separare il più possibile il tessuto tumorale dal tessuto normale circostante.
   2. Rimuovere il più possibile il tessuto necrotico (solitamente identificato come tessuto biancastro pallido situato centralmente all'interno del tumore) dal tumore rimanente.
   3. Utilizzare un bisturi per suddividere un pezzo iniziale di tumore in pezzi approssimativamente uguali (~3 mm x 3 mm) per l'impianto chirurgico di topo (Figura 1).
   4. Facoltativamente, se è disponibile una quantità sufficiente di tessuto tumorale, congelare il tessuto per i saggi a valle (sequenziamento dell'RNA [RNASeq], sequenziamento dell'intero esoma [WES], ecc.).
   5. Prepara un impasto tumorale tritando il tessuto tumorale usando una tecnica a lama incrociata con due lame di bisturi. Tritare i pezzi di tumore il più finemente possibile per formare un impasto, che ora è pronto per l'impianto chirurgico di topo.
   6. In alternativa, se il tessuto tumorale è troppo duro per la dissociazione meccanica, utilizzare una procedura di dissociazione della digestione per formare un impasto gelatinoso e una sospensione unicellulare per l'impianto e/o l'iniezione.
      1. Tritare i pezzi di tumore il più finemente possibile per formare un impasto.
      2. Mettere l'impasto in una provetta da 50 mL con soluzione salinosa bilanciata di Hank fredda (HBSS)^-/- (senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺); quindi, centrifugare il pellet a 220 x g per 4 min a 4 °C.
      3. Risospendere l'impasto in 10 mL di terreno di digestione fresco riscaldato (200 U/mL di collagenasi EV + 5 mM di CaCl₂ + 50 U/mL di DNasi in ^HBSS-/-) per 1 g di tessuto tumorale.
      4. Mettere la provetta in un bagnomaria a 37 °C per 20 minuti e mescolare energicamente ogni 5 minuti con una pipetta monouso.
      5. Lavare con un massimo di 50 ml di HBSS^-/-; quindi, centrifugare a 220 x g per 4 minuti a 4 °C.
      6. Aggiungere 5 mL di TEG preriscaldato (0,025% tripsina + 40 μg/mL di glicole etilenico-bis(β-amminoetil etere)-N,N,N',N'-tetraacetico [EGTA] + 10 μg/mL di alcol polivinilico [PVA]) per 1 g di tessuto tumorale, risospendere/agitare delicatamente e posizionare la provetta a 37 °C per 2 minuti senza mescolare.
      7. Aggiungere almeno 1 volume uguale di terreno di colorazione a freddo (1% di albumina sierica bovina [BSA] + 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico [HEPES] + 1x penicillina-streptomicina in terreno L15) per estinguere la tripsina e centrifugare a 220 x g per 4 minuti a 4 °C.
      8. Risospendere il campione in 10 mL di terreno di colorazione per 1 g di tessuto tumorale e filtrarlo attraverso un filtro cellulare da 40 μm per ottenere una sospensione di una singola cellula per l'iniezione nel topo (Figura 1).
      9. Il liquame rimasto sopra il filtro cellulare può essere raccolto anche per l'impianto chirurgico del topo.
2. Impianto e iniezione di tumore nei topi
   1. Impianto di escissione chirurgica o di tessuto bioptico chirurgico
      nota: Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano sterili mediante sterilizzazione in autoclave o con l'uso di strumenti monouso pre-sterilizzati.
      1. Radere i peli dalla parte bassa della schiena di topi maschi o femmine NSG 6-8 settimane lasciando un'area di circa 1,5 cm x 3 cm senza peli. Anestetizzare i topi usando isoflurano e confermare stringendo delicatamente il piede come test di reattività. Usa un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza.
      2. Posizionare i singoli topi su un cuscinetto termico nel cono nasale della macchina per anestesia, strofinare l'area rasata con clorexidina. Quindi, bagnare con etanolo al 70% e lasciarlo evaporare.
      3. Preparare pezzi o dividere l'impasto tumorale in una capsula di Petri in singoli tumuli per l'impianto chirurgico (cioè, in tre tumuli uguali se da impiantare in 3 topi).
      4. Utilizzando la lama del bisturi, praticare un'incisione di circa 5 mm di lunghezza al centro della parte posteriore del mouse, prelevare un paio di pinze e sollevare la pelle sul lato dell'incisione opposto all'operatore.
      5. Prendi le forbici nell'altra mano e separa la pelle dallo strato muscolare tagliando delicatamente la membrana fasciale con piccoli tagli a forbice, creando così una "tasca" per il tessuto tumorale.
      6. Raccogli un pezzo di tumore o un singolo cumulo di tessuto tumorale con la lama del bisturi e posiziona delicatamente il tessuto nella tasca creata.
      7. Somministrare 100 μL di matrice extracellulare artificiale sul tumulo di tessuto tumorale nella tasca.
      8. Usando due paia di pinze, tirare verso l'alto l'incisione su entrambe le estremità in modo che i bordi della ferita si avvicinino e chiudere la ferita applicando una o due clip per ferite.
      9. Iniettare per via sottocutanea 1-5 mg/kg di meloxicam come analgesico nei topi dopo l'intervento chirurgico.
      10. Togliete il topo dal cono del naso e rimettetelo nella sua gabbia originale; osservate il topo mentre si sveglia. Non tornare in una gabbia fino a quando non si è completamente ripreso.
      11. Rimuovere le clip della ferita dopo circa 7 giorni. Se la guarigione non è completa dopo 7 giorni, lasciare la clip della ferita per altri uno o due giorni.
          nota: Se si utilizza una sospensione di una singola cellula dall'escissione chirurgica o dal trattamento del tessuto bioptico chirurgico, si mescolerà con la matrice extracellulare artificiale (in rapporto 1:1) per l'iniezione nei topi.
   2. Iniezione di FNA o tessuto bioptico centrale
      1. Posizionare un mouse NSG su una griglia di acciaio, tenere saldamente il mouse per la coda e tirare delicatamente indietro il mouse. Afferrerà saldamente la griglia con le zampe anteriori. In alternativa, trattieni il mouse nella mano non dominante e lascia visibile l'area del fianco.
      2. Disinfettare la pelle del fianco con tamponi imbevuti di alcol. Iniettare lentamente e costantemente il contenuto della siringa sotto la pelle del topo.
      3. Estrarre l'ago e riposizionare il mouse nella sua gabbia.
3. Monitorare la crescita del tumore
   1. Monitorare i topi una volta alla settimana per verificare la presenza di tumori palpabili.
   2. Una volta che i tumori hanno raggiunto una dimensione misurabile (circa 50 mm³), utilizzare un calibro per registrare le dimensioni del tumore. Utilizzare la seguente formula per calcolare i volumi tumorali: (larghezza x larghezza x lunghezza) / 2.
   3. Raccogliere il tumore una volta che il volume del tumore raggiunge circa 1,5 cm³ (circa 4-10 settimane). Il tumore è ora chiamato passaggio del topo 1 (MP1).

Figura 1: Metodi di impianto alternativi.(A) I tumori possono essere trasformati in pezzi, in una sospensione di liquame o come sospensione a cellula singola. (B) Tutti e tre i metodi consentiranno la crescita di tumori in vivo. Qui sono mostrati topi impiantati per via sottocutanea con tumore e sottoposti a imaging 12 giorni dopo l'impianto. (C) Sono mostrate le curve di crescita tumorale per i topi iniettati con uno dei tre metodi di impianto. N = 5 per braccio; Le barre di errore sono errori standard.