Metodo della goccia sospesa: una tecnica per generare sferoidi di melanoma 3D

Abstract

Fonte: Müller, I. et al., Un modello 3D di pelle sferoidale di melanoma organotipico. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive la tecnica di generazione di sferoidi tridimensionali tramite il metodo della goccia sospesa utilizzando cellule di melanoma. Il modello di sferoide del melanoma organotipico tridimensionale (3D) generato in vitro può rappresentare l'architettura in vivo del melanoma maligno e può fornire informazioni sulle interazioni intra-tumorali.

Protocollo

1. Generazione di sferoidi di melanoma 3D tramite il metodo della goccia sospesa

1. Coltura di cellule di melanoma (ad es. 451-LU o qualsiasi linea cellulare di melanoma di interesse) secondo protocolli generali, utilizzando RPMI contenente il 10% di FCS.
   1. Per generare sferoidi di melanoma di dimensioni e qualità simili, lavare le cellule di melanoma in PBS, aggiungere 5 ml di 1x tripsina-EDTA in PBS alle cellule in un pallone di coltura cellulare T175 e incubare per 3-5 minuti a temperatura ambiente (RT). Neutralizzare la tripsina aggiungendo 5 ml di RPMI/10% di FCS. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 200 x g per 5 min. Risospendere il pellet cellulare in RPMI/FCS a una concentrazione finale di 10.000 cellule/mL determinata mediante conteggio in un emocitometro.
2. Posizionare 40 x 25 μL (= 250 cellule) della sospensione cellulare sulla superficie interna del coperchio di una piastra sterile per colture cellulari non adesiva (Ø 10 cm) utilizzando una multipipetta elettronica. Con un movimento rapido ma fluido, capovolgere il coperchio e posizionarlo sulla rispettiva piastra di coltura cellulare contenente 5 ml di PBS.
   1. Coltura di "piastre a goccia sospese" in un incubatore cellulare a 37 °C e 5% di CO₂ per 10-14 giorni, a seconda del tipo di cellula utilizzata.
      nota: Le cellule della fase di crescita del melanoma metastatico crescono tipicamente più velocemente e formano sferoidi più solidi nella goccia pendente rispetto alle cellule di melanoma derivate dalla fase di crescita radiale o dalla fase di crescita verticale. Per la valutazione individuale, osservare la crescita degli sferoidi con un binocolo o con un microscopio ottico (ingrandimento 4X). Di solito, gli sferoidi diventano rilevabili dopo 48 ore sotto un binocolo o sotto un microscopio ottico (ingrandimento 4X). Dopo 10-14 giorni, sono visibili senza alcun dispositivo di ingrandimento.
3. Cinque giorni dopo l'individuazione iniziale delle gocce, aggiungere 10 μl di terreno fresco RPMI/10% FCS a ciascuna goccia. Successivamente, scambiare 10 μL di terreno a giorni alterni. L'uso di un dispenser elettronico è molto utile in questa fase.
4. A seconda del tipo di cellula, raccogliere gli sferoidi dopo 10-15 giorni. Sciacquare accuratamente gli sferoidi dal coperchio della piastra di coltura cellulare a goccia sospesa con PBS. Raccogli 10-20 sferoidi in una piastra di coltura cellulare sterile e non adesiva. Rimuovere con cura l'eccesso di PBS con una pipetta Pasteur.
   nota: Il periodo di coltivazione dipende dalla fase di crescita tumorale delle cellule di melanoma quando sono state inizialmente derivate, ad esempio, gli sferoidi derivati dalle cellule 451-LU crescono fino a circa 500 μm di diametro entro 12 giorni dalla coltura nella goccia sospesa.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
albumina sierica fetale (FCS)	Thermo Fisher Scientifico	10270106	Aggiungere il 10 % al terreno di coltura cellulare
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientifico	25300054	1X diluito in PBS
Giri di velocità	Thermo Fisher Scientifico	61870010	Per la coltivazione di linee cellulari di melanoma