Generazione di ricostruzioni organotipiche della pelle completa: una procedura per stabilire un modello di pelle 3D utilizzando campioni di pelle umana

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Isolamento dei cheratinociti primari dall'epidermide

1. Lavare il tessuto epidermico con PBS. Tagliare l'epidermide in pezzi più piccoli (1 mm²) e raccoglierli in una provetta conica da 50 ml. Aggiungere 10 mL di 1x Tripsina-EDTA (preriscaldato a 37 °C) e incubare per 5 minuti in un bagno d'acqua a 37 °C. Agitare la sospensione tissutale ogni 2 minuti.
2. Arrestare la reazione enzimatica aggiungendo 1 ml di siero fetale di vitello (FCS). Risospendere le cellule pipettando su e giù con una pipetta di plastica da 10 ml per 4 minuti. Cerca di evitare la formazione di bolle e schiuma.
3. Pipettare la sospensione cellulare in un colino cellulare (dimensione dei pori 100 μm), posizionato sopra una provetta conica fresca da 50 mL e risciacquare 3 volte con 5 mL di PBS. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 min. Risospendere il pellet cellulare in un terreno di coltura da 2-6 mL contenente l'1% (v/v) di gentamicina. Determinare manualmente il numero di cellule contando le cellule in un emocitometro e seminare 6 x 10⁵ cellule in un pallone di coltura cellulare T75.

2. Isolamento dei fibroblasti primari dal derma

1. Tagliare il tessuto dermico in pezzi più piccoli (1 mm²) e trasferirli in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere 10 mL di soluzione di collagenasi (5 U/mL in PBS⁺) e incubare per 45 minuti a bagnomaria a 37 °C. Centrifugare la miscela di pezzi di tessuto e cellule a 200 x g per 5 minuti.
2. Lavare due volte il pellet cellulare con 10 ml di DMEM contenente 4,5 g/L di glucosio e L-glutammina, ma senza L-piruvato. Infine, risospendere i pezzi di tessuto in 2 mL di DMEM contenenti l'1% (v/v) di gentamicina e il 10% di FCS. Trasferirli in un pallone per colture cellulari T25 e incubarli in un incubatore cellulare a 37 °C e 5% di CO₂ per una notte.
   NOTA: Il volume ridotto consente ai fibroblasti di migrare fuori dai detriti tissutali e li costringe ad attaccarsi al pallone di coltura.
3. La mattina successiva, aggiungere altri 6 mL di DMEM/Gentamicina/FCS e incubare per 2-3 giorni a 37 °C fino a quando le cellule non hanno raggiunto l'80-90% di confluenza.

3. Generazione del compartimento dermico delle ricostruzioni organotipiche della pelle completa

1. Genera modelli di pelle utilizzando inserti di membrana microporosa cellulare a 24 pozzetti (dimensione dei pori 8 μm) posizionati in piastre a 24 pozzetti.
   nota: Assicurati di non utilizzare inserti sospesi ma in piedi, perché verranno inseriti in una piastra a 6 pozzetti per la coltivazione aria-liquido in una fase successiva.
2. Preparare la soluzione di neutralizzazione del gel (GNL), nonché i terreni di coltura denominati MM e i terreni di crescita endoteliali (EGM). Per prevenire la coagulazione, conservare il collagene di tipo I (di solito dalla coda di ratto, 3,5-4 mg/mL in acido acetico 0,02 N) su ghiaccio fino all'uso perché inizia a gelificare a RT.
3. Risospendere 1 x 10⁵ fibroblasti per inserto in GNL e miscelare rapidamente la sospensione cellulare con il collagene in un rapporto di 1:3 in un volume finale di 500 μL/inserto. Mescolare pipettando delicatamente su e giù per evitare la formazione di bolle poiché le bolle possono compromettere la qualità della ricostruzione della pelle.
4. Lasciare depositare i singoli gel dermici mantenendoli senza mezzo a RT per 30 minuti in una cappa sterile. Successivamente, coprire ogni gel con DMEM contenente 4,5 g/L di glucosio, 1% di L-glutammina, 10% di FCS e senza L-piruvato e incubare per una notte a 37 °C.

4. Generazione del compartimento epidermico delle ricostruzioni organotipiche della pelle completa

1. Il giorno successivo, rimuovere il terreno dai gel dermici ed equilibrarli con terreni EGM (10% FCS, 1% PenStrep, 10 mg/mL gentamicina) per 2 ore a 37 °C. Prelevare il terreno e seminare con cura 1 x 10⁵ cheratinociti risospesi in 100 μL di EGM sopra il gel dermico.
2. Incubare i ricostruzioni per 1,5 ore a 37 °C per consentire ai cheratinociti di aderire al compartimento dermico.
   nota: Durante questo periodo di incubazione, i gel inizieranno a restringersi a causa della contrazione indotta dai fibroblasti e, quindi, si staccheranno almeno parzialmente dalle pareti dell'inserto.
3. Coprire gli equivalenti cutanei con circa 800 μl di EGM e rimuovere con cura il gel residuo dalla parete dell'inserto con un piccolo puntale per pipetta (bianco). Coltivare gli equivalenti cutanei immersi in EGM per 7 giorni in un incubatore cellulare a 37 °C, 5% CO₂, e cambiare il terreno a giorni alterni.
   nota: Durante questo periodo, gli equivalenti della pelle si ridurranno in modo significativo.

5. Ricostruzioni organotipiche della pelle intera

1. Al giorno 8, trasferire ciascun inserto in un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere solo 1,2-1,4 mL di terreno MM a ciascun pozzetto, in modo che la ricostruzione cutanea venga alimentata con terreno dal fondo del pozzetto ma non sia coperta con il terreno.
   nota: La coltivazione all'interfaccia aria-liquido consente la stratificazione della parte epidermica e la formazione di uno strato corneo completo.
2. Durante i prossimi 10-17 giorni, cambiare il mezzo come indicato nella sezione 5.1 a giorni alterni. Durante questo periodo, aggiungere droghe o altri stimoli secondo necessità al substrato. Rimuovere con cura la ricostruzione cutanea completa dall'inserto della membrana microporosa utilizzando una pinzetta curva per ulteriori analisi, ad esempio analisi immunoistochimiche (Figura 1).

Figura 1: Coltivazione di ricostruzioni 3D organotipiche della pelle immerse con il terreno e all'interfaccia aria-liquido. Al giorno 0, i cheratinociti primari vengono seminati sopra il compartimento dermico costituito da fibroblasti primari incorporati in una matrice di collagene di tipo I. Le ricostruzioni cutanee 3D rimangono coltivate immerse nell'EGM per 7 giorni, si staccano dalla parete dell'inserto e iniziano a restringersi. Al giorno 8, gli inserti vengono trasferiti in 6 pozzetti e coltivati all'interfaccia aria-liquido per consentire la stratificazione epidermica.