Generazione di ricostruzioni organotipiche della pelle completa: una procedura per stabilire un modello di pelle 3D utilizzando campioni di pelle umana

Abstract

Fonte: Müller, I. et al. Un modello 3D di pelle sferoidale di melanoma organotipico. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive il protocollo dettagliato per la generazione di ricostruzioni cutanee organotipiche in vitro 3D per studiare la progressione del melanoma. Questo modello di pelle imita sia l'architettura che la complessità multicellulare degli organi in vivo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Isolamento dei cheratinociti primari dall'epidermide

1. Lavare il tessuto epidermico con PBS. Tagliare l'epidermide in pezzi più piccoli (1 mm²) e raccoglierli in una provetta conica da 50 ml. Aggiungere 10 mL di 1x Tripsina-EDTA (preriscaldato a 37 °C) e incubare per 5 minuti in un bagno d'acqua a 37 °C. Agitare la sospensione tissutale ogni 2 minuti.
2. ....

Risultati

Figura 1: Coltivazione di ricostruzioni 3D organotipiche della pelle immerse con il terreno e all'interfaccia aria-liquido. Al giorno 0, i cheratinociti primari vengono seminati sopra il compartimento dermico costituito da fibroblasti primari incorporati in una matrice di collagene di tipo I. Le ricostruzioni cutanee 3D rimangono coltivate immerse nell'EGM per 7 giorni, si staccano dalla parete dell'.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
albumina sierica fetale (FCS)	Thermo Fisher Scientifico	10270106	aggiungere il 10 % al terreno di coltura cellulare
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientifico	25300054	1X diluito in PBS
DMEM	Thermo Fisher Scientifico	41965062	per la coltura di fibroblasti primari
Dispase	Tecnologie Gibco Life	17105041	2U/ml, sciogliere in PBS
Collagene di tipo I	BD Bioscienze	354249	di solito dalla coda di ratto, la concentrazione dovrebbe essere di 3,5-4 mg/ml
Inserti a 24 pozzetti Nunclon	Nunc	140629	Dimensione dei pori di 8 μm; utilizzare inserti in piedi, non sospesi
filtro cellulare	Falco BD	Codice 352360	giallo
Gentamicina	Thermo Fisher Scientifico	15750060	dissolvenza in PBS
Keralife cheraticita medium	Sistemi cellulari		non aggiungere FCS o antibiotici
Collagenasi	SERVA	Codice: 17454	Grado standard NB4
cheratinociti umani giovanili	Sistemi cellulari	FC-0007	alternativa alla propria preparazione dal prepuzio giovanile
fibroblasti umani giovanili	Sistemi cellulari	FC-0001	alternativa alla propria preparazione dal prepuzio giovanile
FEG	Tecnologie Gibco Life	Codice 13247-051	aggiungere 10 ng/ml solo per la generazione di terreno EGM
cloruro di calcio	Prodotti chimici Merck	Codice: 2381	aggiungere 1,9 mM per la generazione di EGM e 3,8 mM per il mezzo MM
Acido selenico	Alfa Aesar	Anno 18851	aggiungere 53 nM per la generazione di EGM e MM medium
insulina	Lilly	HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml	aggiungere 5 μg/ml per la generazione di EGM e terreno MM
Etanolammina	Sigma-Aldrich	E-0135	aggiungere 0,1 mM per la generazione di fluidi EGM e MM
P-etanolammina	Sigma-Aldrich	P-0503	aggiungere 0,1 mM per la generazione di fluidi EGM e MM
Olo-transferrina	Sigma-Aldrich	T-0665	aggiungere 5 μg/ml per la generazione di EGM e terreno MM
triiodotironina	Sigma-Aldrich	T-6397	aggiungere 20 pM per la generazione di EGM e MM medium
idrocortisone	Sigma-Aldrich	H-088816	aggiungere 0,4 μg/ml per la generazione di EGM e terreno MM
progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	aggiungere 10 nM solo per la generazione di fluido EGM
Hepes	Sigma-Aldrich	H-3784	aggiungere 15 mM per la generazione di EGM e MM medium
serina	Sigma-Aldrich	S-4311	aggiungere 1 mM per la generazione di EGM e MM medium
Cloruro di colina	Sigma-Aldrich	C-7017	aggiungere 0,64 mM per la generazione di EGM e MM medium
dFCS	Sigma-Aldrich	F-0392 Lotto 086K0361	aggiungere il 2 % per la generazione di EGM e MM medium
adenina	Sigma-Aldrich	A-9795	aggiungere 0,18 mM per la generazione di EGM e MM medium
L-Glutammina	PromoCell	C-42209	aggiungere 7,25 mM per la generazione di EGM e MM medium
Cloruro di stronzio	Sigma-Aldrich	255521	aggiungere 1 mM per la generazione di EGM e MM medium