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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione delle cellule B16-BL6
- Rimuovere le piastre per colture cellulari dall'incubatore a 37 gradi e posizionarle in una cappa sterile. Le placche devono essere confluenti per circa il 70% con le cellule di melanoma murino B16-BL6. Una maggiore confluenza può alterare il potenziale metastatico delle cellule.
- Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% per piastra, lasciare riposare per 1 minuto, quindi aspirare la soluzione di tripsina-media.
- Aggiungere 1 mL di tripsina per piastra e rimettere le piastre nell'incubatore per 10 minuti.
- Dopo aver spostato le piastre dall'incubatore alla cappa sterile, aggiungere 4 mL di terreno privo di siero del Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) a ciascuna piastra.
- Raccogliere le cellule con una pipetta sterile e motorizzata. Espellere le cellule contro il fondo della piastra, con la punta premuta con un angolo molto leggero, per rompere le cellule. Ripetere più volte per garantire un'adeguata separazione dei grumi di cellule, che altrimenti potrebbero ostruire l'ago di espulsione. Prelevare e trasferire in una provetta conica da 50 mL.
- Utilizzare un emocitometro per determinare la densità cellulare. Mantenendo costante il numero totale di cellule B16-BL6, determinare il volume di RPMI senza siero necessario per raggiungere concentrazioni finali di 0, 0,065, 0,015, 0,25 e 0,5 milioni di cellule/mL.
- Aliquotare equamente il terreno nella provetta da 50 mL in provette coniche da 15 mL. Centrifugare le provette coniche a 2.250 x g per 5 min. Decantare i media. Aggiungere un volume appropriato di RPMI senza siero e confermare la densità cellulare desiderata tramite emocitometro. Regola le densità aggiungendo ulteriori RPMI o ruotando e ririattivando in un volume più piccolo di conseguenza.
- Aliquotare 500 μl di ciascuna sospensione cellulare in provette marcate da 1,8 mL su ghiaccio.
2. Iniezione della vena caudale
- Acquista topi femmina C57BL/6 (età 6-8 settimane), 5 topi per gruppo. Attendi alcuni giorni affinché i topi si abituino.
- Prendi un topo, tenuto per la coda, e guidalo all'indietro nel sistema di ritenuta del mouse. Con il busto nella camera principale del sistema di ritenuta e la coda all'esterno, tira il mouse verso l'estremità del sistema di ritenuta. Inserire lo stantuffo di ritenuta, continuando a spingere fino a quando il mouse non è fissato.
- Ruota il mouse di 90 gradi in modo che una delle vene laterali della coda sia rivolta verso l'alto. Usando un tampone imbevuto di alcol, pulisci energicamente il lato della coda del topo, in particolare dove la vena della coda è più visibile.
nota: Una buona illuminazione è essenziale per un'efficace visualizzazione della vena caudale sui topi B57BL/6J. Le lampade termiche o i cuscinetti chirurgici riscaldati, sebbene non necessari, aiuteranno anche aumentando il volume della vena caudale.
- In una cappa di coltura sterile, raccogliere 300 μL di terreno di coltura cellulare dalla provetta da 2 milioni di cellule/mL. Capovolgere l'ago, muovendo il lato e spingendo lo stantuffo, per espellere le bolle dalla siringa. Espellere la coltura-RPMI per ottenere un volume finale di 250 μl.
- Estendi la coda del topo con la mano non dominante. Tenere la coda con l'estremità prossimale della coda sollevata con l'indice della mano non dominante e la parte distale della coda premuta con il pollice.
nota: In questo modo, la vena caudale viene mantenuta in posizione laterale, parallela alla superficie di contenimento, con un'entrata congruente possibile nella parte più distale della coda.
- Inserire l'ago nella vena caudale, verso l'estremità distale, con un angolo di un minuto verso il basso per cominciare, quindi regolare l'ago in modo che corrisponda all'angolo della vena caudale al momento dell'ulteriore inserimento (abbassando l'estremità dello stantuffo della siringa rispetto all'ago).
- Inserire l'ago per circa 1 cm nella vena della coda. Dopo l'inserimento, iniziare a spingere lo stantuffo, tenendo fermo l'ago.
nota: Se l'ago si trova nella vena della coda e l'estremità dell'ago non è ostruita, il terreno deve fluire senza ostacoli nella vena. Un'iniezione efficace è caratterizzata dalla fuoriuscita del sangue dalla vena. Se c'è resistenza o inizia a formarsi una bolla nel sito di iniezione, rimuovere l'ago e riprovare in una posizione più prossimale lungo la vena caudale.
- Rimuovere l'ago dalla vena e gettarlo. Tenere una garza contro il sito di ingresso per fermare qualsiasi sanguinamento.
- Rimuovere lo stantuffo dal sistema di ritenuta e posizionare il mouse nella gabbia del ricevente.
- Ripetere per tutte le altre concentrazioni.
nota: L'instaurazione dei focolai polmonari richiede circa 2-3 settimane, con variabilità a seconda della linea cellulare e delle dimensioni desiderate dei focolai. Nel frattempo, i topi dovrebbero essere monitorati per i sintomi che potrebbero giustificare l'eutanasia precoce come l'eccessivo ansimare.
3. Contare i focolai polmonari
- Sopprimere il topo mettendolo in una camera di CO2 ed esponendolo al 100% di CO2 introdotto al 10-30% del volume della camera al minuto per 5 minuti. Seguire con lussazione cervicale.
- Allarga il mouse sul polistirolo. Usando le forbici chirurgiche, crea un'incisione chirurgica lungo lo sterno.
- Fai due incisioni aggiuntive, entrambe dalla parte superiore dell'incisione dello sterno e ramificate verso le spalle del topo, esponendo la gabbia toracica.
- Fai due tagli, ciascuno lungo i lati laterali dello sterno, per rimuovere la gabbia toracica dal busto, esponendo i polmoni e il cuore.
- Tenendo il cuore con una pinzetta chirurgica, tagliare l'esofago e la trachea, liberando il cuore e i polmoni dal topo. Posizionare sotto un microscopio da dissezione, con ingrandimento 10X, per una migliore visualizzazione.
- Sezionare il cuore dai polmoni e rimuovere il timo, lasciando solo i due polmoni.
- Con i polmoni sotto un cannocchiale da dissezione, iniziare a contare i focolai polmonari. Ogni focolaio dovrebbe apparire come un'ostruzione circolare e marrone sulla superficie dei polmoni.
- Per coerenza tra i topi, conta il numero di focolai sulla superficie di un lobo, quindi inverti quel lobo. Eseguire ciascuno dei quattro lobi individualmente consente un conteggio più facile.
- Salvare e riparare i polmoni se si esegue l'IHC, altrimenti scartare i resti.