HCR-DNA FISH: Una tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza per rilevare il DNA virale nelle cellule infette

Abstract

Fonte: Wei Liu et al., Infezione e rilevamento del poliomavirus a cellule di Merkel, J. Vis. (2019).

In questo video, le cellule infettate da virioni MCPyV sono state sottoposte a reazione a catena di ibridazione in situ per rilevare genomi specifici di MCPyV. Inoltre, la tecnica DNA-HCR è stata combinata con la FISH per visualizzare il DNA MCPyV nelle cellule della pelle umana infetta.

Protocollo

1. Infezione

1. Mantenere i fibroblasti dermici umani primari in DMEM con il 10% di siero fetale di vitello, l'1% di aminoacidi non essenziali e l'1% di L-glutammina. Al raggiungimento della confluenza, dividere i fibroblasti 1:4 senza rotare verso il basso.
   nota: Per la massima efficienza di infezione da MCPyV, utilizzare fibroblasti primari tra i passaggi 5 e 12 che si dividono attivamente al momento della piastra.
2. Per infettare i fibroblasti dermici umani, aspirare il terreno e lavare le cellule con DPBS.
3. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% alla piastra e incubare a 37 °C per 5-10 minuti.....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Buffer di ibridazione della sonda	Tecnologie molecolari
Tampone di lavaggio della sonda	Tecnologie molecolari
Buffer di amplificazione	Tecnologie molecolari
Forcine con etichetta Alexa 594	Tecnologie molecolari	B4	Proteggi dalla luce
Paraformaldeide	Sigma	P6148