HCR-DNA FISH: Una tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza per rilevare il DNA virale nelle cellule infette

Abstract

Fonte: Wei Liu et al., Infezione e rilevamento del poliomavirus a cellule di Merkel, J. Vis. (2019).

In questo video, le cellule infettate da virioni MCPyV sono state sottoposte a reazione a catena di ibridazione in situ per rilevare genomi specifici di MCPyV. Inoltre, la tecnica DNA-HCR è stata combinata con la FISH per visualizzare il DNA MCPyV nelle cellule della pelle umana infetta.

Protocollo

1. Infezione

1. Mantenere i fibroblasti dermici umani primari in DMEM con il 10% di siero fetale di vitello, l'1% di aminoacidi non essenziali e l'1% di L-glutammina. Al raggiungimento della confluenza, dividere i fibroblasti 1:4 senza rotare verso il basso.
   nota: Per la massima efficienza di infezione da MCPyV, utilizzare fibroblasti primari tra i passaggi 5 e 12 che si dividono attivamente al momento della piastra.
2. Per infettare i fibroblasti dermici umani, aspirare il terreno e lavare le cellule con DPBS.
3. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% alla piastra e incubare a 37 °C per 5-10 minuti.
4. Controllare al microscopio per assicurarsi che le cellule si stacchino dal piatto.
5. Aggiungere 10 mL di terreno DMEM/F12 contenente 20 ng/mL di EGF, 20 ng/mL di bFGF e 3 μM di CHIR99021, che stimolano l'infezione da MCPyV, nel piatto e trasferire la soluzione cellulare in una provetta da 15 mL.
6. Centrifugare le cellule a 180 x g per 2 minuti e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in terreno DMEM/F12 contenente 20 ng/mL di EGF, 20 ng/mL di bFGF e 3μM CHIR99021 a 2-4 x 10⁴ cellule per mL.
7. Seminare 200 μL della sospensione cellulare integrata con 1 mg/mL di collagenasi di tipo IV in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Scongelare il virione MCPyV sul ghiaccio. Aggiungere^10.9 genoma virale equivalenti di virioni MCPyV per 1 μL di iodixanolo per ogni 2.500-5.000 cellule da infettare. Picchiettare delicatamente il lato della piastra e posizionare la piastra nell'incubatore.
8. Dopo l'incubazione a 37 °C in CO₂ al 5% per 48-72 h, aggiungere il 20% di FBS in ciascun pozzetto.
9. Lasciare procedere l'infezione a 37 °C in CO₂ al 5% per 72-96 h.

2. DNA-HCR in situ

1. Fissare le cellule coltivate su vetrini coprioggetti con il 4% di PFA in PBS per 10 minuti. Lavare i vetrini due volte con PBS, quindi trattarli con etanolo al 70% per permeabilizzare le cellule a 4 °C durante la notte.
   nota: I campioni corretti possono rimanere in questo stato per diversi giorni.
2. Pre-ibridare i campioni sostituendo l'etanolo con un tampone di ibridazione a sonda e incubando per 60 minuti a RT.
3. Diluire la/e sonda/e (1 μM) (Tabella 1) in una soluzione tampone di ibridazione della sonda a diluizione 1:500 30 minuti prima della fine della fase di pre-ibridazione e incubare a 45 °C.
4. Al termine delle incubazioni, pipettare ~10 μL della miscela di sonda diluita per vetrino coprioggetti su vetrini da microscopio. Posizionare i vetrini, con la cella rivolta verso il basso, sulle rispettive goccioline della miscela di sonde di ibridazione. Sigillare i bordi e il retro dei vetrini coprioggetti ai vetrini con una quantità generosa di cemento di gomma.
5. Riscaldare i vetrini con l'aggiunta di sonde a 94 °C per 3 minuti posizionando i vetrini sul lato piatto di un blocco termico. Trasferire i vetrini in una camera umidificata e incubare a 45 °C per una notte. Per realizzare una semplice camera umidificata, inumidire leggermente dei tovaglioli di carta sterili con dH₂O e posizionarli sul fondo di un contenitore di plastica che si chiude con una guarnizione in gomma.
   nota: Durante il riscaldamento, il cemento di gomma può gorgogliare brevemente. Tuttavia, assicurarsi che il sigillo non si rompa.
6. Staccare con cura il cemento di gomma con una pinza e riposizionare i vetrini coprioggetti con la cella rivolta verso l'alto nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Lavare i vetrini coprioggetti con il tampone di lavaggio della sonda a RT tre volte.
7. Incubare il vetrino coprioggetti nel tampone di amplificazione (200 μl in piastre a 24 pozzetti) a RT per 30-60 minuti.
8. Nel frattempo, ricuocere ciascuna delle due forcine di oligonucleotidi marcate riconoscendo le sonde (Tabella 1) in provette PCR separate riscaldando a 94 °C per 90 s e raffreddando a RT per 30 minuti, proteggendo dalla luce. Mescolare le due forcine nel tampone di amplificazione, ciascuna a una diluizione di 1:50.
9. Creare una superficie per la reazione di amplificazione stendendo la pellicola di paraffina sulla faccia aperta di un coperchio per piastre a 24 pozzetti. Pipettare 50-100 μl di goccioline della miscela hairpin/tampone di amplificazione sulla pellicola di paraffina per ciascun vetrino coprioggetti. Utilizzare una pinza per rimuovere con cura i vetrini coprioggetti dalla soluzione di preamplificazione. Asciugare il vetrino coprioggetti toccando il bordo di una salvietta monouso porosa e posizionare il lato cellulare rivolto verso il basso sulla gocciolina di amplificazione.
10. Posizionare il coperchio della piastra che contiene i vetrini coprioggetti in una camera umidificata e incubare per una notte a RT al buio.
11. Rimetti i vetrini coprioggetti nei pozzetti ancora una volta. Incubare i campioni con 5x SSCT [5x cloruro di sodio citrato di sodio (SSC) 0,1% Tween 20 filtrato attraverso un filtro da 0,22 μm] contenente 0,5 μg/mL di DAPI per 1 ora a RT. Lavare i campioni due volte con 5x SSCT a RT.
12. Montare i vetrini coprioggetti sui vetrini del microscopio. Analizza le cellule e visualizza i campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita.

Sonda MCPyV 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggaggaggccccaagcctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
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Sonda MCPyV 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 6	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 7	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcggaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 8	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 9	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttgaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 10	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda HPV 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctctgtgggtctt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda HPV 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtcttccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda HPV 3	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda HPV 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcgggggggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda HPV 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctctccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Tabella 1: Sonde utilizzate nello studio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Buffer di ibridazione della sonda	Tecnologie molecolari
Tampone di lavaggio della sonda	Tecnologie molecolari
Buffer di amplificazione	Tecnologie molecolari
Forcine con etichetta Alexa 594	Tecnologie molecolari	B4	Proteggi dalla luce
Paraformaldeide	Sigma	P6148