Isolamento dei cheratinociti della pelle umana: un metodo per coltivare i cheratinociti primari da campioni di pelle

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Isolamento dei cheratinociti dalla pelle umana

1. Inizia preparando le seguenti soluzioni: 50 ml di soluzione allo 0,25% di tripsina e 0,1% di glucosio in DPBS. Miscelare e filtrare sterilizzare (0,2 μm) la soluzione. Preparare 10 mL di RPMI-1640 + 2% di soluzione FBS, 50 mL di DPBS e terreno privo di siero per cheratinociti (KSFM). Aggiungere integratori KSFM e 250 μL di gentamicina a 500 mL di KSFM. Preriscaldare le soluzioni a 37 °C prima dell'uso.
2. Raccogli la pelle da volontari adulti sani sottoposti a chirurgia plastica. I campioni di pelle utilizzati sono di circa 10 cm x 15 cm, ma possono variare di dimensioni. Mantenere la pelle fresca durante il trasporto trasportando i campioni di pelle in una scatola di polistirolo contenente un elemento di raffreddamento. Se necessario, il campione di pelle può essere conservato a 4 °C per una notte.
3. Rimuovere il grasso da sotto la sezione della pelle usando forbici, bisturi e pinze sterilizzati.
4. Allaccia la sezione cutanea (circa 10 cm x 15 cm) su una copertura sterile sopra una placca usando degli aghi. Per prima cosa, pulisci la pelle con una garza sterilizzata a secco. Quindi, pulire la pelle utilizzando una garza sterilizzata con etanolo al 70%.
5. Con l'aiuto di una pialla, tagliare lo strato superiore (epidermide) della sezione cutanea e metterlo in una capsula di Petri di 9 cm. Quindi, aggiungere immediatamente 25 mL della soluzione DPBS/tripsina/glucosio (preparata al punto 1.1) alla piastra di Petri. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
6. Utilizzando una pipetta, rimuovere la soluzione DPBS/tripsina/glucosio dalla piastra di Petri e aggiungere 10 ml di RPMI-1640 + 2% FBS per inattivare la tripsina.
7. Utilizzando due pinze, rilasciare ora le cellule epidermiche nel terreno raschiando delicatamente e agitando sia il compartimento epidermico che quello dermico delle sezioni cutanee.
8. Filtrare la sospensione cellulare epidermica attraverso un filtro metallico (foro da 1 mm) e raccoglierla in una provetta da 50 mL. Aggiungere le restanti sezioni cutanee in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di RPMI-1640 senza FBS e vorticare per 10 s. Filtrare la sospensione attraverso il filtro metallico in una provetta da 50 ml contenente la sospensione cellulare epidermica. Aggiungere DPBS a un volume totale di 50 mL.
9. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 450 x g a temperatura ambiente.
10. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cellule epidermiche in circa 10 mL di KSFM a 37 °C, a seconda delle dimensioni del pellet cellulare. Contare le cellule utilizzando il metodo di colorazione con blu di tripano al microscopio. Il numero di cellule ottenute da una sezione cutanea di 10 cm x 15 cm è di circa 50-100 x 10⁶ cellule. In ogni matraccio di coltura^{da 75 cm 2}, trasferire 8 x 10⁶ cellule insieme a 12 mL di KSFM a 37 °C. Agitare delicatamente i palloni di coltura per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.
11. Incubare i cheratinociti in un'incubatrice a 37 °C con il 100% di umidità e il 5% di CO₂. Cambia il mezzo dopo 2 giorni e tre volte alla settimana. Cellule di passaggio quando la coltura è confluente al 70-80%, il che richiede circa 2 settimane a seconda del tasso di proliferazione dei cheratinociti.