Isolamento dei cheratinociti della pelle umana: un metodo per coltivare i cheratinociti primari da campioni di pelle

Abstract

Johansen, C. et al. Generazione e coltura di cheratinociti umani primari da pelle adulta. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video descrive l'isolamento dei cheratinociti, le cellule più importanti dello strato epidermico della pelle umana, impiegando una combinazione di metodi di digestione enzimatica e di interruzione meccanica. Questo metodo aiuta nella crescita preferenziale dei cheratinociti rispetto ad altri tipi di cellule della pelle utilizzando un mezzo di crescita selettivo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Isolamento dei cheratinociti dalla pelle umana

1. Inizia preparando le seguenti soluzioni: 50 ml di soluzione allo 0,25% di tripsina e 0,1% di glucosio in DPBS. Miscelare e filtrare sterilizzare (0,2 μm) la soluzione. Preparare 10 mL di RPMI-1640 + 2% di soluzione FBS, 50 mL di DPBS e terreno privo di siero per cheratinociti (KSFM). Aggiungere integratori KSFM e 250 μL di gentamicina a 500 mL di KSFM. Preriscaldare le soluzioni a 37 °C prima dell'uso.
2. Raccogli la pelle da volontari adulti sani sottoposti a chirurgia plastica. I campioni di pelle utilizzati sono di circa 10 cm x 15 cm, ma possono variare di dimensioni. Mantenere la pelle fresca durante il trasporto trasportando i campioni di pelle in una scatola di polistirolo contenente un elemento di raffreddamento. Se necessario, il campione di pelle può essere conservato a 4 °C per una notte.
3. Rimuovere il grasso da sotto la sezione della pelle usando forbici, bisturi e pinze sterilizzati.
4. Allaccia la sezione cutanea (circa 10 cm x 15 cm) su una copertura sterile sopra una placca usando degli aghi. Per prima cosa, pulisci la pelle con una garza sterilizzata a secco. Quindi, pulire la pelle utilizzando una garza sterilizzata con etanolo al 70%.
5. Con l'aiuto di una pialla, tagliare lo strato superiore (epidermide) della sezione cutanea e metterlo in una capsula di Petri di 9 cm. Quindi, aggiungere immediatamente 25 mL della soluzione DPBS/tripsina/glucosio (preparata al punto 1.1) alla piastra di Petri. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
6. Utilizzando una pipetta, rimuovere la soluzione DPBS/tripsina/glucosio dalla piastra di Petri e aggiungere 10 ml di RPMI-1640 + 2% FBS per inattivare la tripsina.
7. Utilizzando due pinze, rilasciare ora le cellule epidermiche nel terreno raschiando delicatamente e agitando sia il compartimento epidermico che quello dermico delle sezioni cutanee.
8. Filtrare la sospensione cellulare epidermica attraverso un filtro metallico (foro da 1 mm) e raccoglierla in una provetta da 50 mL. Aggiungere le restanti sezioni cutanee in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di RPMI-1640 senza FBS e vorticare per 10 s. Filtrare la sospensione attraverso il filtro metallico in una provetta da 50 ml contenente la sospensione cellulare epidermica. Aggiungere DPBS a un volume totale di 50 mL.
9. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 450 x g a temperatura ambiente.
10. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cellule epidermiche in circa 10 mL di KSFM a 37 °C, a seconda delle dimensioni del pellet cellulare. Contare le cellule utilizzando il metodo di colorazione con blu di tripano al microscopio. Il numero di cellule ottenute da una sezione cutanea di 10 cm x 15 cm è di circa 50-100 x 10⁶ cellule. In ogni matraccio di coltura^{da 75 cm 2}, trasferire 8 x 10⁶ cellule insieme a 12 mL di KSFM a 37 °C. Agitare delicatamente i palloni di coltura per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.
11. Incubare i cheratinociti in un'incubatrice a 37 °C con il 100% di umidità e il 5% di CO₂. Cambia il mezzo dopo 2 giorni e tre volte alla settimana. Cellule di passaggio quando la coltura è confluente al 70-80%, il che richiede circa 2 settimane a seconda del tasso di proliferazione dei cheratinociti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
KSFM	ThermoFisher Scientifico	Codice 17005-034	Terreno di coltura cellulare
Integratori KSFM	ThermoFisher Scientifico	Codice 37000-015	Integratori per KSFM
DPBS	ThermoFisher Scientifico	Codice 14190-144	DPBS senza Calcio e Magnesio
Dmso	Sigma-Aldrich	D8418	Dimetilsolfossido
Gentamicina	ThermoFisher Scientifico	Codice 15710-049	Additivo per terreni di coltura cellulare
Filtro di sterilizzazione	Sartorius	Codice: 16534	Filtro per siringa con una dimensione dei pori di 0,2 μm
tripsina	Sigma-Aldrich	T7409	Utilizzato per tripsinizzare le cellule
glucosio	Sigma-Aldrich	G7528	-
RPMI-1640	ThermoFisher Scientifico	Codice 61870-010	-
FBS	ThermoFisher Scientifico	16000044	Usato per inattivare la tripsina
forcipe	-	-	Le pinze di qualsiasi azienda possono essere usato
forbici	-	-	Le forbici di qualsiasi azienda possono essere usato
bisturi	Swann Morton	Codice 0501	I bisturi di qualsiasi azienda possono essere usato
70% etanolo	-	-	-
Garze	NOBAMED	Codice 875420	Le garze di qualsiasi fornitore possono essere utilizzato
Pialla a pedale	Credo Solingen	Anno 1510	La pialla a pedale di qualsiasi fornitore può essere utilizzato
Piastre di Petri	TPP	Codice 93100	Le piastre di Petri di qualsiasi fornitore possono essere utilizzato
Filtro metallico	-	-	Foro interno da 1 mm in metallo filtro
2 fiasche di coltura da 75 cm	Nunc	156499	-
150 cm2 fiasche di coltura	Ttp	Codice 90151	-
Soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05%	ThermoFisher Scientifico	Codice 25300-062	Utilizzato per tripsinizzare le cellule quando passaggio