Articolo metodologico

Isolamento delle cellule staminali del melanoma: un metodo per ottenere cellule di melanoma CD133 positive e negative utilizzando la selezione cellulare attivata magneticamente

30 aprile 2023

In questo articolo

Abstract

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Fonte: Welte, Y. et al. Coltura cellulare derivata dal paziente e isolamento di cellule staminali tumorali putative CD133+ dal melanoma. J. Vis. Exp. (2013)

Questo video descrive la tecnica di isolamento delle cellule staminali CD133 negative e positive del melanoma da una linea cellulare primaria di melanoma utilizzando la selezione cellulare attivata magneticamente. Le CSC del melanoma CD133 positive sono state ulteriormente studiate per comprendere i meccanismi della tumorigenesi del melanoma.

Protocollo

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1. Smistamento Cellulare Magnetico di Cellule di Melanoma CD133+ e CD133- utilizzando Colonne LS

  1. Preparare il tampone MACS contenente 2 mM EDTA e il 5% di FCS in PBS. Miscelare mediante tampone invertente e filtrato sterile utilizzando un'unità filtrante Steritop-GP da 0,22 μm. Raffreddare il tampone a 4-8 °C e degasare prima dell'uso.
  2. Preriscaldare il terreno Accutase, PBS e Quantum 263 a 37 °C.
  3. Lavare l'80% delle cellule confluenti con PBS. Aggiungere una quantità appropriata di Accutase e incubare fino a quando le cellule non si staccano dalla superficie di coltura. Raccogliere le cellule in una provetta da 50 mL utilizzando il terreno Quantum 263.
  4. Determinare il numero di celle e centrifugare il numero richiesto di celle per 5 minuti a 300 x g e 4-8 °C. (Secondo il protocollo di Miltenyi, è possibile caricare un massimo di 2x 109 celle per colonna LS. I numeri ottimali specifici della linea cellulare dovrebbero essere determinati e possono essere considerevolmente inferiori.) Aspirare completamente il surnatante.
  5. Risospendere un massimo di 1x 108 cellule con 350 μL di tampone MACS (per un numero maggiore di cellule, aumentare di conseguenza tutti i volumi successivi del tampone MACS, del reagente bloccante FcR, del CD133/1-Biotina e delle microsfere anti-biotina).
  6. Aggiungere 100 μl di reagente bloccante FcR.
  7. Aggiungere 50 μl di CD133/1-biotina. Mescolare bene con un vortice e incubare a 4-8 °C per 10 min.
  8. Lavare le celle aggiungendo 10 mL di tampone MACS e centrifugare per 5 minuti a 300 x g e 4-8 °C. Aspirare completamente il surnatante.
  9. Ripetere la fase di lavaggio (1.8).
  10. Pellet di cella di risospensione con tampone MACS da 400 μl.
  11. Aggiungere 100 μl di microsfere anti-biotina. Mescolare bene con un vortice e incubare a 4-8 °C per 15 min.
  12. Nel frattempo, preparare il separatore MACS per la separazione magnetica. Collegare QuadroMACS al supporto multiplo del separatore MACS. Inserire il numero richiesto di colonne LS con le alette della colonna in avanti nel campo magnetico del QuadroMACS. Posizionare un filtro di pre-separazione (con rete di nylon da 30 μm) in ciascuna colonna LS e una provetta di raccolta appropriata (15 mL o 50 mL) sotto ciascuna colonna. Preparare il filtro e la colonna risciacquando con 3 ml di tampone MACS. Scartare il flusso continuo.
  13. Lavare le celle aggiungendo 10 mL di tampone MACS e centrifugare per 5 minuti a 300 x g e 4-8 °C. Aspirare completamente il surnatante.
  14. Risospendere le cellule con un tampone MACS da 500 μL e applicare la sospensione cellulare sulla colonna LS con il filtro di pre-separazione.
  15. Lavare tre volte con 3 mL di tampone MACS per colonna. Aggiungere il tampone fresco solo quando il serbatoio della colonna è vuoto.
  16. L'effluente totale raccolto contiene la frazione cellulare CD133- non marcata.
  17. Eliminare il filtro di pre-separazione, rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su una provetta di raccolta adatta.
  18. Applicare 5 ml di tampone MACS. Sciacquare immediatamente le cellule CD133+ marcate spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna.
  19. Per aumentare la purezza della frazione negativa, applicare la sospensione cellulare su una nuova colonna LS bilanciata inserita nel QuadroMACS. L'effluente contiene la frazione CD133-.
  20. Eliminare le colonne.

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Accutase PAA Laboratories GmbHL11-007
Sale disodico dell'acido etilendiamminotetraacetico disodico (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc.E-7889
CD133/1 (W6B3C1)Miltenyi Biotec GmbH130-092-395
Kit micro-perline CD133 indiretto umano Miltenyi Biotec GmbHCodice 130-091-895Include: CD133/1 (AC133)-Biotina, microsfere anti-biotina e reagente bloccante FcR
Quantum 263 PAA Laboratories GmbHCampionato U15-815
MACS Separatore Multi Stand Miltenyi Biotec GmbHCodice 130-042-303
Colonne di separazione MACS 25 colonne LS Miltenyi Biotec GmbHCodice 130-042-401
Separatore QuadroMACS Miltenyi Biotec GmbHCodice 130-090-976

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Cellule staminali del melanomacellule CD133 positivecellule CD133 negativeisolamento di cellule staminali cancerosecellule primarie di melanomatampone MACSmicroperle anti biotinacolonna LSreagente di blocco FcR

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