Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Animali da esperimento, reagenti e attrezzature
- Usa topi di età e sesso corrispondenti. Inizia lo studio a 7-9 settimane di età perché la pelle nella maggior parte dei topi è in telogen (la fase di riposo) intorno a quell'età.
- Osserva il comportamento degli animali durante lo studio e se combattono, cosa che spesso accade con i maschi, ospitali separatamente. I combattimenti possono causare tagli nella pelle, che favoriscono la formazione di tumori. Le femmine di topo sono preferite per il loro comportamento meno aggressivo. La dimensione tipica del gruppo sperimentale varia tra 8-20 animali per gruppo.
nota: I calcoli di potenza basati sulla varianza biologica osservata in studi precedenti aiutano a scegliere una dimensione del gruppo sufficientemente ampia. I ceppi utilizzati come esempi in questo articolo includono Balb/c e C57BL/6. Tuttavia, molti altri ceppi di topi, come SENCAR e FVB, sono stati utilizzati con il modello DMBA-TPA e i ratti Wistar e Sprague-Dawley. Prima dell'inizio dello studio è necessaria una licenza del comitato nazionale o locale per il lavoro sugli animali. Oltre alle considerazioni generali sul benessere, gli endpoint specifici del modello sono tipicamente il carcinoma a cellule squamose (SCC) e l'infezione della pelle. I graffi sulla pelle dovuti al prurito dopo l'applicazione delle sostanze chimiche tumorigeniche nell'acetone sono tipici, ma per il resto gli animali non dovrebbero mostrare segni di disagio. Pesare regolarmente (ad esempio, 2 volte al mese) aiuta a valutare il benessere degli animali.
- Utilizzare DMBA e TPA, entrambi diluiti in acetone. La concentrazione di lavoro di DMBA è di 250 g/L. Una dose per un animale è di 50 μg di DMBA in 200 μL di acetone. La concentrazione madre di TPA è di 125 g/L e la concentrazione di trattamento è di 25 g/L. Una dose di TPA per un animale è di 5 μg in 200 μL di acetone.
ATTENZIONE: Il DMBA è dannoso se ingerito e può causare il cancro. L'acetone evapora rapidamente ed è infiammabile. Può causare vertigini e irritare gli occhi. Utilizzare una maschera respiratoria e/o lavorare sotto un flusso di vuoto. Cambiare i guanti dopo aver maneggiato una di queste sostanze chimiche. Le gabbie ventilate individualmente impediscono la diffusione delle sostanze chimiche durante l'alloggiamento dei topi. Dopo l'applicazione, raccogliere i puntali delle pipette utilizzati per la manipolazione del DMBA e smaltirli come rifiuti pericolosi.
nota: Il DMBA deve essere protetto dalla luce. Il TPA diluito viene conservato a -20 °C, preferibilmente al riparo dalla luce.
- Procuratevi la seguente attrezzatura: una bilancia, un normale rasoio per la pelliccia, pipette e punte di dimensioni adeguate, un normale righello, una macchina fotografica digitale, un blocco note e una penna o un computer per registrare i papillomi, un sistema di anestesia inalatoria o un sistema di ritenuta per topi con un'apertura sulla parte superiore posteriore e un sistema di narcosi ad anidride carbonica per sacrificare i topi.
2. Induzione e promozione del papilloma cutaneo
- Radere la pelle della schiena e pesare l'animale. Successivamente, radere la pelle ogni volta che è necessario, ma non al momento dell'esposizione chimica.
nota: Fai attenzione quando ti radi intorno ai papillomi ed evita di fare tagli sulla pelle. Pesare ogni animale ogni 2 settimane per notare qualsiasi potenziale perdita di peso.
- Applicare 50 μg di DMBA in 200 μL di acetone per via topica sulla zona rasata utilizzando una pipetta 48 ore dopo la rasatura del pelo. Se necessario, trattenere l'animale utilizzando una leggera anestesia per inalazione o un sistema di ritenuta per topi.
- Dopo 7 giorni, somministrare la prima dose di TPA. Applicare 5 μg di TPA in 200 μL di acetone per via topica con una pipetta 2 volte alla settimana, preferibilmente lunedì e giovedì o martedì e venerdì.
- Conta, registra e fotografa i papillomi ogni settimana. Una massa palpabile superiore a 1 mm di diametro è considerata un papilloma se rimane più di 1 settimana. Segna ogni singolo papilloma su una mappa ed elenca le sue dimensioni ogni settimana: conserva le fotografie digitali.
