Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Isolamento di melanociti e fibroblasti
- Eutanasia di cuccioli maschi e/o femmine di C57Bl/6J di età compresa tra 0 e 4 giorni mediante decapitazione e rimozione delle estremità dai topi soppressi utilizzando le forbici chirurgiche.
- In una cappa a flusso laminare, arrotolare brevemente il tronco di ciascun topo in una capsula di Petri sterile contenente il 70% di etanolo. Togliete il tronco dall'etanolo e mettetelo in una capsula di Petri vuota e sterile.
- Utilizzando delle forbici chirurgiche, sterilizzate in etanolo al 70%, praticare un'incisione nella pelle sul lato ventrale del tronco partendo dal collo fino alla coda. Staccare la pelle dal tronco del topo usando una pinza sterile.
- Mettere la pelle, con il derma rivolto verso il basso, in un piatto a 6 pozzetti contenente 3 ml di soluzione antibiotica/antimicotica 1x e incubare a temperatura ambiente per 2-3 minuti.
- Accendere il tritatutto con le seguenti impostazioni: Spessore fetta: 1 μm; Forza della lama: ~60% del massimo; Velocità: ~50% del massimo.
- Trasferire la pelle, con il derma rivolto verso il basso, in un disco tritatessuti sterile e passare completamente la pelle attraverso il trinciatessuti attivato 3 volte.
- Trasferire la pelle omogeneizzata in una provetta conica sterile da 15 ml contenente 3 ml di tampone per la digestione cutanea (preparare 3 ml di tampone per la digestione cutanea fresco contenente il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina/streptomicina in soluzione, l'1% di L-glutammina, 10 mg/mL di collagenasi di tipo I, lo 0,25% di tripsina suina e 0,02 mg/mL di desossiribonucleasi I in RPMI 1640). Miscelare la sospensione risultante pipettando su e giù 10-15 volte con una micropipetta P1000.
- Tappare la provetta conica e incubare il campione in un bagno d'acqua a 37 °C per 15 minuti, capovolgendo la provetta ogni 3-5 minuti.
- Pellettare le cellule dell'omogeneizzato cutaneo centrifugando la provetta conica in un rotore a secchiello oscillante a 750 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Utilizzando una micropipetta P1000, rimuovere lentamente e completamente il tampone per la digestione cutanea, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
nota: Una parte dell'intera pelle può essere salvata in questa fase e utilizzata come controllo per la conferma della purezza cellulare. Filtrare queste cellule attraverso un filtro cellulare da 70 μm e procedere ulteriormente.
- Risospendere accuratamente il pellet cellulare in 1 mL di terreno melanocitario pipettandolo su e giù 15-20 volte con una micropipetta P1000. Aggiungere la soluzione cellulare risultante goccia a goccia in un pozzetto non rivestito di una piastra a 6 pozzetti contenente 1 mL di terreno melanocitario.
- Posizionare l'omogeneizzato cutaneo placcato in un incubatore per colture tissutali impostato a 37 °C e 5% di CO2. Lasciare incubare le colture per 40 min.
nota: Durante questo periodo, alcuni fibroblasti nell'omogenato cutaneo aderiranno al piatto non rivestito mentre i melanociti e i cheratinociti rimangono in sospensione.
- Trasferire il surnatante di coltura dalla piastra non rivestita a un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti prelavata e rivestita di collagene. Aggiungere G418 al terreno in modo che la concentrazione finale sia di 100 ng/mL.
- Aggiungere 2 mL di Fibroblast Media a un pozzetto della piastra non rivestita, che ora contiene fibroblasti aderenti.
- Incubare entrambe le colture per una notte in un incubatore per colture tissutali impostato a 37 °C e 5% di CO2.
- Aspirare separatamente il terreno e gli eventuali detriti da ciascuna coltura, 16-24 ore dopo la piastratura. Lavare ogni piatto due volte con 1 mL di PBS sterile, quindi aggiungere 2 mL di terreno di coltura per melanociti fresco più 100 ng/mL di G418 alla coltura di melanociti e 2 mL di terreno di coltura per fibroblasti freschi alla coltura di fibroblasti. (Preparare 6 ml di terreno melanocitario fresco contenente il 10% di siero fetale bovino, il 7% di siero equino, l'1% di penicillina/streptomicina, l'1% di L-glutammina, 0,5 mM di di-butirrile ciclico AMP (dbcAMP), 20 nM di tetradecanoilforbolo 13-acetato (TPA) e 200 pM di tossina del colera (CT) nel Nutrient Mix F-12 Ham's media.
NOTA: Le soluzioni madre concentrate di dbcAMP, TPA e CT possono essere prodotte, aliquotate e conservate per >1 anno a -80 °C. I terreni di base privi di questi componenti possono essere conservati fino a 1 mese a 4 °C.
Preparare 4 ml di terreno per fibroblasti contenente il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina/streptomicina e l'1% di L-glutammina nel terreno Eagle modificato di Dulbecco. Questo supporto può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 mese)
- Dopo che le colture di melanociti sono state trattate con G418 per 48 ore, lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS sterile e aggiungere 2 mL di terreno melanocitico fresco senza G418 alla coltura.
nota: Poiché i fibroblasti nella coltura dei melanociti continuano a morire dopo il trattamento con G418, lavare il piatto con PBS sterile per rimuovere le cellule morte e aggiungere nuovi terreni melanociti. Le colture di melanociti e fibroblasti devono essere passate quando raggiungono la confluenza del 70-80%.