Preparazione del virion del poliomavirus a cellule di Merkel ricombinante (MCPyV): una tecnica per produrre virion MCPyV ricombinante ad alto titolo

Abstract

Fonte: Wei Liu et al. Infezione e rilevamento del poliomavirus a cellule di Merkel, J. Vis. (2019)

In questo video, mostriamo la preparazione del poliomavirus a cellule di Merkel o virioni MCPyV utilizzando cellule 273TT. Questa tecnologia aiuta a produrre virioni MCPyV ricombinanti ad alto titolo.

Protocollo

1. Preparazione del virione MCPyV ricombinante

1. Digerire 50 μg di plasmide pR17b (che trasporta il genoma MCPyV) con 250 U di BamHI-HF in un volume di 200 μL (4 ore a 37 °C) per separare il genoma virale dalla spina dorsale del vettore (Figura 1).
2. Aggiungere 1200 μL di tampone PB (integrato con 10 μL di NaAc 3 M, pH 5,2) al DNA digerito e purificare su 2 colonne di centrifughe miniprep (capacità di DNA di 20 μg). Eluire il plasmide pR17b digerito da ciascuna colonna con 200 μL di tampone TE (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA).
3. Preparare la reazione di legatura in una provetta da centrifuga da 50 mL. Aggiungere 400 μL di DNA plasmidico purificato dalla fase 1.2, 8,6 mL di tampone ligasi T4 1,05x e 6 μL di ligasi T4 ad alta concentrazione. Incubare a 16 °C per una notte.
4. Aggiungere 45 mL di tampone PB (integrato con 10 μL di NaAc 3 M, pH 5,2) alla legatura e utilizzare un collettore a vuoto per caricare attraverso 2 colonne di centrifuga miniprep. Eluire ogni colonna con 50 μl di tampone TE. Aspettatevi una resa di circa 30 μg di DNA.
5. Nel tardo pomeriggio/sera, seminare 6 x 10⁶ cellule 293TT in un piatto di 10 cm contenente DMEM medium integrato con il 10% di siero fetale di vitello, l'1% di aminoacidi non essenziali e l'1% di L-glutammina senza igromicina B.
6. La mattina successiva, assicurati che le celle siano confluenti per circa il 50%. Trasfettare utilizzando 66 μL di reagente di trasfezione (1,1 μL/cm²), 12 μg di DNA R17b isolato MCPyV relegato dallo step 1.4, 8,4 μg di plasmide di espressione ST pMtB e 9,6 μg di plasmide di espressione LT pADL.
7. Quando le cellule trasfettate sono quasi confluenti, il giorno seguente, tripsinizzare le cellule e trasferirle in un piatto di 15 cm per un'espansione continua.
8. Opzionalmente, prelevare un piccolo numero di cellule 293TT al momento dell'espansione ed eseguire la colorazione IF per MCPyV LT (CM2B4) e VP1 (MCV VP1 rabbit) per determinare l'efficienza della trasfezione. In questa fase, i segnali LT nucleari possono essere visibili, ma l'espressione di VP1 probabilmente non sarà rilevabile.
9. Quando la piastra di 15 cm diventa quasi confluente (di solito 5-6 giorni dopo la trasfezione iniziale), trasferire le cellule in tre piastre di 15 cm. Raccogli le cellule dalle piastre da 15 cm quando diventano quasi confluenti e segui il protocollo di raccolta del virus riportato di seguito.
   nota: Opzionalmente eseguire il controllo di qualità IF come descritto al punto 1.8. La maggior parte delle cellule dovrebbe essere positiva sia per MCPyV LT che per VP1 in questa fase.
10. Per raccogliere il virus, tripsinizzare le cellule, centrifugare a 180 x g per 5 minuti a RT e rimuovere il surnatante. Aggiungere un volume di pellet cellulare di DPBS-Mg (DPBS con 9,5 mM di MgCl₂ e 1x antibiotico-antimicotico). Quindi, aggiungere 25 mM di solfato di ammonio (da una soluzione madre a pH 9 1 M) seguiti da Triton X-100 allo 0,5% (da una soluzione madre al 10%), benzonasi allo 0,1% e 0,1% di una DNasi ATP-dipendente. Mescolare bene e incubare a 37 °C per una notte.
11. Incubare la miscela per 15 minuti con ghiaccio e poi aggiungere 0,17 volumi di NaCl 5M. Mescolare e incubare con ghiaccio per altri 15 minuti. Centrifugare per 10 minuti a 12.000 x g in una centrifuga a 4 °C. Se il surnatante non è limpido, capovolgere delicatamente il tubo e ripetere la fase di centrifuga. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
12. Risospendere il pellet utilizzando un volume di DPBS integrato con 0,8 M di NaCl e centrifugare nuovamente, come descritto al punto 1.11.
13. Combina i surnatanti dei passaggi 1.11 e 1.12 e gira ancora una volta come descritto nel passaggio 1.11.
14. Versare gradienti di iodixanolo in provette di poliallomero da 5 mL a parete sottile mediante sottoposizione (27%, poi 33%, poi 39%) a passi di ~0,7 mL utilizzando una siringa da 3 mL dotata di un ago lungo o di una pipetta p1000.
15. Caricare 3 mL di surnatante chiarificato contenente virus sul gradiente di iodixanolo preparato.
16. Centrifuga per 3,5 ore a 234.000 x g e 16 °C in un rotore SW55ti. Impostare l'accelerazione e la decelerazione su Slow.
17. Dopo l'ultracentrifugazione, raccogliere 12 frazioni in provette siliconate (ogni frazione è ~400 μL).
18. Analizzare le frazioni per la presenza di virus mediante reagente dsDNA e/o Western blot per VP1 (MCV VP1 rabbit). Raggruppare le frazioni di gradiente con il contenuto di picco di dsDNA e/o VP1 e caratterizzare lo stock mediante PCR quantitativa per calcolare l'equivalente del genoma virale. Conservare il virione MCPyV a -80 °C.

Risultati

Figura 1. Produzione di virione MCPyV utilizzando il genoma virale ricombinante.(A) Una mappa plasmidica di pR17b (plasmide del genoma MCPyV). (B) Un'immagine rappresentativa di un campione di virione MCPyV raccolto e purificato su un gradiente. La freccia segna la banda dei virioni MCPyV concentrati nel nucleo del gradiente. (C) Il numero di copie d...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM/F12 medio	Thermo Fisher Scientifico	Codice 11330-032
Proteina EGF umana ricombinante, FC	Sistemi di ricerca e sviluppo	236-EG-200	Conservare a -80 gradi Celsius
CHIR99021	Cayman Chimica	Codice: 13122	Conservare a -80 gradi Celsius
CHIR99021	sigma	SML1046	Conservare a -80 gradi Celsius
Collagenasi tipo IV	Thermo Fisher Scientifico	17104019
Applicazione II	Roche	4942078001
Antibiotico-Antimicotico	Thermo Fisher Scientifico	Codice 15240-062	Proteggere dalla luce
DMEM medio	Thermo Fisher Scientifico	11965084
Paraformaldeide	sigma	P6148
Anti-MCPyV LT (CM2B4)	Santa Cruz	SC-136172	Lotto # B2717
MCV VP1 coniglio		Siero policlonale di coniglio #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm