Visualizzazione dell'espressione proteica basata su CUBIC: una procedura per visualizzare l'espressione proteica nelle biopsie cutanee di topo a tutto spessore

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Preparazione del tessuto cutaneo trasparente del topo

NOTA: Tutti i topi utilizzati in questo studio avevano un background genetico C57BL/6

1. Raccolta di tessuto cutaneo di topo.
   1. Sopprimere umanamente i topi mediante lussazione cervicale.
   2. Rimuovere con cautela i peli dall'area cutanea interessata con un rifinitore, facendo attenzione a non ferire la pelle.
   3. Lavare la pelle per decontaminarla con etanolo al 70% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   4. Sollevare la pelle dorsale del collo con una pinza e praticare un'incisione con le forbici.
   5. Sezionare un'ampia area di pelle dorsale del topo (circa 1,5 x 4 cm).
   6. Appiattire la pelle, con il derma rivolto verso il basso, su una carta da filtro e prendere nota dell'orientamento antero-posteriore del campione.
   7. Tagliare la carta da filtro intorno alla pelle sezionata e metterla in una provetta da 15 ml riempita con una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% (PFA) appena preparata in PBS.
   8. Fissare per 1 ora a temperatura ambiente, oppure per una notte in frigorifero a 4 °C.
   9. Lavare la pelle 2 volte 5 minuti in PBS in una provetta da 15 ml.
      nota: I seguenti (1.1.10 - 1.1.12) sono passaggi facoltativi per la conservazione a lungo termine dei tessuti.
   10. Disidratare la pelle sezionata in PBS con una concentrazione crescente di etanolo (25%, 50%, 70%) in una provetta da 15 ml durante le fasi di lavaggio di 1 ora a temperatura ambiente.
   11. Conservare la pelle disidratata in etanolo al 70% in PBS in una provetta da 15 ml a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
   12. Quattro ore prima della pulizia, reidratare il tessuto cutaneo in PBS con una concentrazione decrescente di etanolo (70%, 50%, 25%, 0%) in una provetta da 15 ml durante le fasi di lavaggio di 1 ora a temperatura ambiente.
2. Eliminazione delle biopsie cutanee del topo
   1. Preparare la soluzione di chiarificazione CUBIC1 sciogliendo 3,85 g di urea e 3,85 g di N,N,N',N'-tetrakis (2-idrossipropil) etilendiammina in 5,38 mL di acqua distillata su un riscaldatore impostato a 60-70 °C. Utilizzare un agitatore caldo.
   2. Aggiungere 2,31 g di polietilenglicole mono-p-isoottilfeniletere/Triton X-100 alla soluzione una volta che è limpida e si è raffreddata a temperatura ambiente.
   3. Tagliare la pelle del topo con una lama di rasoio affilata in biopsie di dimensioni approssimative 0,2 x 0,5 cm e immergerla in 5 mL di soluzione schiarente CUBIC1 in una provetta da 15 mL. Per ottimizzare la visualizzazione dei follicoli piliferi, assicurarsi che il lato più lungo della biopsia sia tagliato lungo la direzione antero-posteriore del campione.
   4. Porre su una piattaforma rotante in un forno di ibridazione a 37 °C.
   5. Sostituire la soluzione di chiarificazione dopo 7 giorni. Preparare una soluzione fresca di CUBIC1 prima dell'uso.
   6. Controllare la trasparenza del tessuto dopo 7 giorni. Se necessario, lasciare le biopsie nella soluzione di pulizia CUBIC1 fino a quando il tessuto non è completamente trasparente.
   7. Una volta che la biopsia cutanea è trasparente, rimuovere la soluzione CUBIC1 e aggiungere 4 mL di 1x PBS per lavare il tessuto 4 volte per 6 ore a 37 °C.
   8. Lavare il tessuto cutaneo in saccarosio al 20% p/v in PBS in un tubo da 15 ml per 4 ore a 37 °C.
   9. Congelare il tessuto nel terreno di montaggio Composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) in una provetta da 15 ml per una notte in un congelatore a -80 °C.
      nota: Questo passaggio aumenterà la permeabilità della biopsia per la penetrazione degli anticorpi nelle fasi successive.

2. Colorazione in immunofluorescenza

1. Scongelare il fazzoletto da (passaggio 1.2.9) a temperatura ambiente per 2 - 3 ore.
2. Lavare il fazzoletto nella provetta da 15 ml con 5 ml di PBS per 8 ore a temperatura ambiente per rimuovere il composto OCT.
3. Trasferire le biopsie in una provetta da 2 ml e incubare il tessuto in 1 ml di anticorpo anti-cheratina14 di coniglio o anti-Ki67 di coniglio, entrambi diluiti 1:100 in PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) per 3 giorni su uno shaker in un forno a 37 °C.
4. Trasferire le biopsie in una provetta da 15 ml e lavare il tessuto 4 volte per 6 ore in 5 ml di PBST su uno shaker in un forno a 37 °C.
5. Trasferire le biopsie in una provetta da 2 mL, aggiungere 1 mL di anticorpo secondario Alexa594 anti-coniglio diluito 1:100 in PBST e incubare 3 giorni su uno shaker in un forno a 37 °C.
6. Trasferire le biopsie in una provetta da 15 ml e lavare il tessuto 4 volte per 6 ore in 5 ml di PBST su uno shaker in un forno a 37 °C.
7. Trasferire le biopsie in una provetta da 2 mL, aggiungere 1 mL di soluzione di controcolorante nucleare 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (1:1.000) in PBST e incubare per una notte su un agitatore in un forno a 37 °C.
8. Rimuovere la soluzione di controcolorazione DAPI e aggiungere 1 mL di PBST alla provetta da 2 mL per lavare il fazzoletto 4 volte per 6 ore su uno shaker in un forno a 37 °C.
   nota: Passaggio opzionale: le biopsie possono essere conservate al buio in 1x PBS con azoturo di sodio allo 0,02% per almeno 3 settimane.

3. Imaging

1. Preparare la soluzione di chiarificazione CUBIC2, che contiene il 50% (p/v) di saccarosio, il 25% (p/v) di urea, il 10% (p/v) di 2,2',2''-nitrilotriteanolo e lo 0,1% (v/v) di Triton X-100.
2. Incubare il tessuto cutaneo in 1 mL di soluzione di CUBIC2 in una provetta da 2 mL su un agitatore per 24 ore in un forno a 37 °C. Questo passaggio uniformerà l'indice di rifrazione del tessuto.
3. Controllare la limpidezza del tessuto. Una volta che è trasparente, posizionare l'intera biopsia cutanea (0,2 x 0,5 cm) sul lato più lungo su un vetrino coprioggetti, in modo che la direzione della lunghezza dei follicoli piliferi sia parallela alla superficie del vetrino coprioggetti (#1 24 x 60 mm).
   nota: Passaggio opzionale: le biopsie colorate con anticorpi possono essere conservate nella soluzione CUBIC2 per circa 7 giorni. Le biopsie colorate con rosso del Nilo possono essere conservate solo in soluzione CUBIC2 per un massimo di 1 giorno e devono essere sottoposte a imaging il prima possibile.
4. Preparare la camera di imaging (Figura 1).
   NOTA: I materiali di consumo necessari per la preparazione della camera di imaging sono: puntina blu, plastilina o simili e 2 vetrini coprioggetti (24 x 50 mm) (Figura 1A).
   1. Preparare due strisce sottili di puntina blu (diametro circa 1 mm x 2 cm) e due vetrini coprioggetti (Figura 1B).
   2. Posizionare le strisce adesive blu su un vetrino coprioggetti, lasciando spazio sufficiente per la biopsia cutanea (Figura 1C, passaggio 3.4.3).
   3. Posizionare la biopsia cutanea tra le strisce del vetrino coprioggetti in una goccia di soluzione CUBIC2 (Figura 1C).
   4. Coprire la biopsia cutanea con il secondo vetrino coprioggetti (Figura 1D).
5. Posizionare la camera di imaging con la biopsia cutanea montata sul tavolino di un microscopio confocale e spostare il tessuto nel percorso della luce.
6. Scansiona il campione utilizzando una sorgente luminosa al mercurio o alogena e filtri standard per l'epifluorescenza (ad es. DAPI/GFP/CY3/CY5) per identificare le regioni di interesse colorate in fluorescenza.
7. Immagini delle regioni di interesse utilizzando un obiettivo 10X e 20X (NA 0,75) e tecniche di imaging a fluorescenza confocale standard (ad esempio, con campioni colorati DAPI illuminarsi con un laser a 405 nm e raccogliere il segnale di fluorescenza tra 425-475 nm, e con Alexa Fluor 594 o campioni colorati con Nile Red illuminare con un laser a 561 nm e raccogliere il segnale di fluorescenza tra 570-620 nm).
8. Genera Z-stack di immagini di ciascuna regione di interesse utilizzando il software di acquisizione delle immagini Z-stack per microscopio (ad esempio, utilizzando il software di imaging degli elementi NIS 4.13 come descritto di seguito).
   1. Garantisci una potenza laser ottimale e seleziona le impostazioni PMT HV/Offset per raccogliere la fluorescenza del campione.
   2. Aprire la barra degli strumenti "Acquisizione ND" da "Controlli di acquisizione".
   3. Seleziona la scheda "Impostazione serie Z" (assicurati che tutte le altre schede siano deselezionate).
   4. Durante la scansione in tempo reale, concentrarsi sulla parte superiore del campione e premere il pulsante "Top".
   5. Concentrati sul fondo del campione e premi il pulsante "Bottom".
   6. Inserire la dimensione del passo richiesta (o premere il pulsante della dimensione del passo ottimizzata).
   7. Premere il pulsante "Esegui ora".
   8. Salva gli Z-stack risultanti come singoli stack di immagini Tiff (1 fluorocromo per Z-stack di immagini).
9. Utilizza gli Z-stack di immagini per ricostruire le regioni di volume 3D di interesse utilizzando il software di analisi 3D (ad esempio, utilizzando Imaris x64 7.2.3 come descritto di seguito).
   1. Avvia il software di analisi.
   2. Scegli il pulsante "Supera" nella barra degli strumenti per la generazione di volumi 3D.
   3. Apri la prima immagine a colori Z-stack (ad esempio, DAPI).
   4. Usa lo strumento 'aggiungi canale' per aggiungere ulteriori canali di colore, un canale per fluorocromo. Pertanto, un campione contenente sia fluorocromi DAPI che Alexa Fluor 594 richiederà due canali.
   5. Utilizzare lo strumento "Proprietà immagine" per impostare le dimensioni corrette dei pixel (voxel) (XYZ), come determinato nella sezione 3.7 precedente.
   6. Utilizzare lo strumento "Regolazione display" per modificare i colori dei canali secondo necessità (ad esempio, impostare il canale DAPI su blu, il canale Alexa Fluor 594 su rosso).
   7. Per posizionare il volume 3D nella finestra dell'immagine, utilizzare il mouse del computer per fare clic e trascinare il volume come richiesto.
   8. Usa lo strumento "Istantanea" nella barra degli strumenti per generare screenshot dell'immagine 3D.
   9. Utilizzare lo strumento "Animazione" nella barra degli strumenti per generare filmati di rotazione di campioni 3D.

Figura 1: Preparazione della camera di imaging. R: I materiali di consumo necessari per la preparazione della camera di imaging sono puntina blu, plastilina o simili e 2 vetrini coprioggetti (24 x 50 mm). B: Preparare due strisce sottili di puntina blu (diametro circa 2 mm x 2 cm) e due vetrini coprioggetti. C: Posizionare le strisce di puntine blu su un vetrino coprioggetti, lasciando spazio sufficiente per la biopsia cutanea. Posizionare la biopsia cutanea in una goccia di soluzione CUBIC2 tra le due strisce. D: Posizionare il secondo vetrino coprioggetti su strisce adesive blu per coprire la biopsia cutanea.