Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Preparazione del tessuto cutaneo trasparente del topo
NOTA: Tutti i topi utilizzati in questo studio avevano un background genetico C57BL/6
- Raccolta di tessuto cutaneo di topo.
- Sopprimere umanamente i topi mediante lussazione cervicale.
- Rimuovere con cautela i peli dall'area cutanea interessata con un rifinitore, facendo attenzione a non ferire la pelle.
- Lavare la pelle per decontaminarla con etanolo al 70% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Sollevare la pelle dorsale del collo con una pinza e praticare un'incisione con le forbici.
- Sezionare un'ampia area di pelle dorsale del topo (circa 1,5 x 4 cm).
- Appiattire la pelle, con il derma rivolto verso il basso, su una carta da filtro e prendere nota dell'orientamento antero-posteriore del campione.
- Tagliare la carta da filtro intorno alla pelle sezionata e metterla in una provetta da 15 ml riempita con una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% (PFA) appena preparata in PBS.
- Fissare per 1 ora a temperatura ambiente, oppure per una notte in frigorifero a 4 °C.
- Lavare la pelle 2 volte 5 minuti in PBS in una provetta da 15 ml.
nota: I seguenti (1.1.10 - 1.1.12) sono passaggi facoltativi per la conservazione a lungo termine dei tessuti.
- Disidratare la pelle sezionata in PBS con una concentrazione crescente di etanolo (25%, 50%, 70%) in una provetta da 15 ml durante le fasi di lavaggio di 1 ora a temperatura ambiente.
- Conservare la pelle disidratata in etanolo al 70% in PBS in una provetta da 15 ml a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
- Quattro ore prima della pulizia, reidratare il tessuto cutaneo in PBS con una concentrazione decrescente di etanolo (70%, 50%, 25%, 0%) in una provetta da 15 ml durante le fasi di lavaggio di 1 ora a temperatura ambiente.
- Eliminazione delle biopsie cutanee del topo
- Preparare la soluzione di chiarificazione CUBIC1 sciogliendo 3,85 g di urea e 3,85 g di N,N,N',N'-tetrakis (2-idrossipropil) etilendiammina in 5,38 mL di acqua distillata su un riscaldatore impostato a 60-70 °C. Utilizzare un agitatore caldo.
- Aggiungere 2,31 g di polietilenglicole mono-p-isoottilfeniletere/Triton X-100 alla soluzione una volta che è limpida e si è raffreddata a temperatura ambiente.
- Tagliare la pelle del topo con una lama di rasoio affilata in biopsie di dimensioni approssimative 0,2 x 0,5 cm e immergerla in 5 mL di soluzione schiarente CUBIC1 in una provetta da 15 mL. Per ottimizzare la visualizzazione dei follicoli piliferi, assicurarsi che il lato più lungo della biopsia sia tagliato lungo la direzione antero-posteriore del campione.
- Porre su una piattaforma rotante in un forno di ibridazione a 37 °C.
- Sostituire la soluzione di chiarificazione dopo 7 giorni. Preparare una soluzione fresca di CUBIC1 prima dell'uso.
- Controllare la trasparenza del tessuto dopo 7 giorni. Se necessario, lasciare le biopsie nella soluzione di pulizia CUBIC1 fino a quando il tessuto non è completamente trasparente.
- Una volta che la biopsia cutanea è trasparente, rimuovere la soluzione CUBIC1 e aggiungere 4 mL di 1x PBS per lavare il tessuto 4 volte per 6 ore a 37 °C.
- Lavare il tessuto cutaneo in saccarosio al 20% p/v in PBS in un tubo da 15 ml per 4 ore a 37 °C.
- Congelare il tessuto nel terreno di montaggio Composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) in una provetta da 15 ml per una notte in un congelatore a -80 °C.
nota: Questo passaggio aumenterà la permeabilità della biopsia per la penetrazione degli anticorpi nelle fasi successive.
2. Colorazione in immunofluorescenza
- Scongelare il fazzoletto da (passaggio 1.2.9) a temperatura ambiente per 2 - 3 ore.
- Lavare il fazzoletto nella provetta da 15 ml con 5 ml di PBS per 8 ore a temperatura ambiente per rimuovere il composto OCT.
- Trasferire le biopsie in una provetta da 2 ml e incubare il tessuto in 1 ml di anticorpo anti-cheratina14 di coniglio o anti-Ki67 di coniglio, entrambi diluiti 1:100 in PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) per 3 giorni su uno shaker in un forno a 37 °C.
- Trasferire le biopsie in una provetta da 15 ml e lavare il tessuto 4 volte per 6 ore in 5 ml di PBST su uno shaker in un forno a 37 °C.
- Trasferire le biopsie in una provetta da 2 mL, aggiungere 1 mL di anticorpo secondario Alexa594 anti-coniglio diluito 1:100 in PBST e incubare 3 giorni su uno shaker in un forno a 37 °C.
- Trasferire le biopsie in una provetta da 15 ml e lavare il tessuto 4 volte per 6 ore in 5 ml di PBST su uno shaker in un forno a 37 °C.
- Trasferire le biopsie in una provetta da 2 mL, aggiungere 1 mL di soluzione di controcolorante nucleare 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (1:1.000) in PBST e incubare per una notte su un agitatore in un forno a 37 °C.
- Rimuovere la soluzione di controcolorazione DAPI e aggiungere 1 mL di PBST alla provetta da 2 mL per lavare il fazzoletto 4 volte per 6 ore su uno shaker in un forno a 37 °C.
nota: Passaggio opzionale: le biopsie possono essere conservate al buio in 1x PBS con azoturo di sodio allo 0,02% per almeno 3 settimane.
3. Imaging
- Preparare la soluzione di chiarificazione CUBIC2, che contiene il 50% (p/v) di saccarosio, il 25% (p/v) di urea, il 10% (p/v) di 2,2',2''-nitrilotriteanolo e lo 0,1% (v/v) di Triton X-100.
- Incubare il tessuto cutaneo in 1 mL di soluzione di CUBIC2 in una provetta da 2 mL su un agitatore per 24 ore in un forno a 37 °C. Questo passaggio uniformerà l'indice di rifrazione del tessuto.
- Controllare la limpidezza del tessuto. Una volta che è trasparente, posizionare l'intera biopsia cutanea (0,2 x 0,5 cm) sul lato più lungo su un vetrino coprioggetti, in modo che la direzione della lunghezza dei follicoli piliferi sia parallela alla superficie del vetrino coprioggetti (#1 24 x 60 mm).
nota: Passaggio opzionale: le biopsie colorate con anticorpi possono essere conservate nella soluzione CUBIC2 per circa 7 giorni. Le biopsie colorate con rosso del Nilo possono essere conservate solo in soluzione CUBIC2 per un massimo di 1 giorno e devono essere sottoposte a imaging il prima possibile.
- Preparare la camera di imaging (Figura 1).
NOTA: I materiali di consumo necessari per la preparazione della camera di imaging sono: puntina blu, plastilina o simili e 2 vetrini coprioggetti (24 x 50 mm) (Figura 1A).
- Preparare due strisce sottili di puntina blu (diametro circa 1 mm x 2 cm) e due vetrini coprioggetti (Figura 1B).
- Posizionare le strisce adesive blu su un vetrino coprioggetti, lasciando spazio sufficiente per la biopsia cutanea (Figura 1C, passaggio 3.4.3).
- Posizionare la biopsia cutanea tra le strisce del vetrino coprioggetti in una goccia di soluzione CUBIC2 (Figura 1C).
- Coprire la biopsia cutanea con il secondo vetrino coprioggetti (Figura 1D).
- Posizionare la camera di imaging con la biopsia cutanea montata sul tavolino di un microscopio confocale e spostare il tessuto nel percorso della luce.
- Scansiona il campione utilizzando una sorgente luminosa al mercurio o alogena e filtri standard per l'epifluorescenza (ad es. DAPI/GFP/CY3/CY5) per identificare le regioni di interesse colorate in fluorescenza.
- Immagini delle regioni di interesse utilizzando un obiettivo 10X e 20X (NA 0,75) e tecniche di imaging a fluorescenza confocale standard (ad esempio, con campioni colorati DAPI illuminarsi con un laser a 405 nm e raccogliere il segnale di fluorescenza tra 425-475 nm, e con Alexa Fluor 594 o campioni colorati con Nile Red illuminare con un laser a 561 nm e raccogliere il segnale di fluorescenza tra 570-620 nm).
- Genera Z-stack di immagini di ciascuna regione di interesse utilizzando il software di acquisizione delle immagini Z-stack per microscopio (ad esempio, utilizzando il software di imaging degli elementi NIS 4.13 come descritto di seguito).
- Garantisci una potenza laser ottimale e seleziona le impostazioni PMT HV/Offset per raccogliere la fluorescenza del campione.
- Aprire la barra degli strumenti "Acquisizione ND" da "Controlli di acquisizione".
- Seleziona la scheda "Impostazione serie Z" (assicurati che tutte le altre schede siano deselezionate).
- Durante la scansione in tempo reale, concentrarsi sulla parte superiore del campione e premere il pulsante "Top".
- Concentrati sul fondo del campione e premi il pulsante "Bottom".
- Inserire la dimensione del passo richiesta (o premere il pulsante della dimensione del passo ottimizzata).
- Premere il pulsante "Esegui ora".
- Salva gli Z-stack risultanti come singoli stack di immagini Tiff (1 fluorocromo per Z-stack di immagini).
- Utilizza gli Z-stack di immagini per ricostruire le regioni di volume 3D di interesse utilizzando il software di analisi 3D (ad esempio, utilizzando Imaris x64 7.2.3 come descritto di seguito).
- Avvia il software di analisi.
- Scegli il pulsante "Supera" nella barra degli strumenti per la generazione di volumi 3D.
- Apri la prima immagine a colori Z-stack (ad esempio, DAPI).
- Usa lo strumento 'aggiungi canale' per aggiungere ulteriori canali di colore, un canale per fluorocromo. Pertanto, un campione contenente sia fluorocromi DAPI che Alexa Fluor 594 richiederà due canali.
- Utilizzare lo strumento "Proprietà immagine" per impostare le dimensioni corrette dei pixel (voxel) (XYZ), come determinato nella sezione 3.7 precedente.
- Utilizzare lo strumento "Regolazione display" per modificare i colori dei canali secondo necessità (ad esempio, impostare il canale DAPI su blu, il canale Alexa Fluor 594 su rosso).
- Per posizionare il volume 3D nella finestra dell'immagine, utilizzare il mouse del computer per fare clic e trascinare il volume come richiesto.
- Usa lo strumento "Istantanea" nella barra degli strumenti per generare screenshot dell'immagine 3D.
- Utilizzare lo strumento "Animazione" nella barra degli strumenti per generare filmati di rotazione di campioni 3D.
