Modificazione genetica dei cheratinociti umani primari: un metodo per manipolare geneticamente i cheratinociti utilizzando retrovirus ricombinanti

Abstract

Fonte: Li, J. et al. Generazione di colture di pelle organotipiche geneticamente modificate utilizzando derma umano devitalizzato. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video descrive un protocollo dettagliato per la produzione di retrovirus ricombinanti di cheratinociti umani primari geneticamente modificati. Questo metodo può essere utilizzato per manipolare l'espressione genica nei cheratinociti.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Cheratinociti umani primari geneticamente modificanti

NOTA: Usa cellule di fenice anfotropica coltivate in terreni DMEM completi [DMEM + 10% di siero fetale bovino (FBS) + penna/streptococco] per produrre virus per infettare i cheratinociti umani primari. I geni di imballaggio virale che codificano proteine come gag-pol e envelope sono integrati stabilmente nel genoma della cellula fenice, che consente la produzione di virus quando trasfettato con un vettore retrovirale. Le cellule Phoenix possono essere trasfettate con un'elevata efficienza, consentendo un'elevata produzione di titoli virali. I virus prodotti da questa linea di confezionamento possono anche infettare una grande varietà di cellule di mammifero, compresi gli esseri umani.

1. Giorno 1: il giorno prima della trasfezione, seminare le cellule fenice in una piastra a 6 pozzetti a una densità di 800.000 cellule per pozzetto in terreno DMEM completo.
2. Giorno 2: il giorno della trasfezione, utilizzare 3 μg di vettori retrovirali per pozzetto. Aliquotare 3 μg di vettore retrovirale in una provetta da 1,5 mL. Utilizzare una miscela di 100 μl di DMEM più 6 μl di reagente di trasfezione per ogni 3 μg di vettore. Miscelare 6 μl di reagente di trasfezione con 100 μl di DMEM in una provetta da 1,5 mL. (I vettori retrovirali utilizzati sono elencati nella tabella delle apparecchiature/materiali)
   1. Incubare per 5 minuti e aggiungere la miscela da 106 μl nella provetta pre-aliquotata contenente 3 μg di vettore retrovirale. Mescolare e incubare a RT per 30 min. Aggiungere l'intera miscela goccia a goccia a ciascun pozzetto delle celle della fenice.
3. Giorno 3: Il giorno dopo la trasfezione, rimuovere il terreno dalle cellule phoenix e aggiungere 2 mL di terreno DMEM completo fresco. Lo stesso giorno, seminare cheratinociti umani primari in piastre a 6 pozzetti a una densità di 75.000 cellule per pozzetto. Mantenere i cheratinociti in un terreno privo di siero di cheratinociti (KCSFM) con antibiotici (penna/streptococco).
   nota: Sono stati acquistati cheratinociti umani primari. Le celle possono essere acquistate da una varietà di fornitori (elencati nella tabella Materiali).
4. Giorno 4: Raccogli i terreni dalle cellule di fenice trasfettate, che ora contengono particelle virali. Far passare il terreno attraverso un filtro da 0,45 μm utilizzando una siringa (per rimuovere eventuali cellule di fenice contaminanti) e posizionare 2 mL sui cheratinociti (placcati a 75.000 cellule/pozzetto il giorno precedente). Aggiungere esadimetrina bromuro (5 μg/mL) al terreno per aiutare a mediare il processo di infezione. I titoli virali sono ~1 x 10⁷ TU/mL.
   1. Centrifugare le piastre a 6 pozzetti in una centrifuga a 200 x g per 1 ora a RT. Dopo la centrifuga, rimuovere il terreno contenente il virus e lavare le celle una volta con 1x PBS prima di aggiungere KCSFM.
5. Giorno 5: Infettare nuovamente lo stesso lotto di cheratinociti come in 1.4, utilizzando 2 mL di terreno filtrato contenente bromuro di esadimetrina (5 μg/mL). Centrifugare a 200 x g per 1 ora a RT per rimuovere i terreni contenenti virus e lavare con 1x PBS, quindi aggiungere KCSFM.
   nota: Selezionare i cheratinociti utilizzando un farmaco se esiste un marcatore selezionabile sul vettore retrovirale ed espanderli per l'uso nell'analisi a valle o in applicazioni come le colture organotipiche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Linee cellulari di fenice anfotropica	ATCC	Codice CRL-3213
Reagente di trasfezione FUGENE 6	Promega	E2691
Cheratinociti Media (KCSFM)	Tecnologie per la vita	17005042
DMEM	GIBCO	Anno 11995
cheratinociti neonatali umani	ATCC	Codice-200-010
cheratinociti neonatali umani	Applicazioni cellulari	102K-05n
Vettore retrovirale MSCV	Clontech	634401
Vettore retrovirale LZRS	Addgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vettore	Oligomotore	VEC-PRT-0002
bromuro di esadimetrina	sigma	H9268-5G
FBS	GIBCO	Codice 10437-028
PENNA/STREPTOLO	GIBCO	Codice: 15140-122