Saggio di formazione di colonie di cheratinociti: un test in vitro per valutare la capacità dei cheratinociti di crescere in colonie

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Raccolta e semina dei cheratinociti primari

1. Eutanasia da quattro a cinque topi femmine adulte tramite inalazione di CO₂ secondo gli standard approvati per la struttura animale/IACUC. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato anche per topi singoli femmina/maschio.
   1. Tagliare circa 9 cm² del pelo dorsale con un tosatrice elettrico per animali e mettere tutti i topi tosati in un barattolo da 500 ml con una quantità sufficiente di soluzione antisettica di iodio povidone (non strofinare) per coprirli per 1-2 minuti. Agitare bene il barattolo per ricoprire uniformemente la soluzione antisettica sui topi.
   2. Versare la soluzione e risciacquare con acqua pulita fino a quando il liquido non diventa limpido. Ripetere lo stesso lavaggio antisettico seguito da un risciacquo con acqua. Dopo il lavaggio antisettico con soluzione di iodio, immergere tutti i topi in etanolo al 70% per 5-10 min.
      NOTA: I topi con pelo chiaro (ad es. BALB/c) manterranno un leggero colore giallastro dai lavaggi antisettici allo iodio, mentre i topi più scuri (ad es. C57BL/6) non lo faranno. In particolare, la vitalità cellulare o la crescita della coltura non sono influenzate a causa del colore giallo.
2. Rimuovere con cautela la pelle dorsale tagliata utilizzando una pinza per il pollice e le forbici in un cappuccio a flusso laminare. Posizionare la pelle dorsale asportata in una provetta conica riempita con gentamicina PBS/2x. Evitare l'uso della pelle laterale ventrale per prevenire la contaminazione delle cellule mammarie in coltura.
3. Usando una pinza autoclavata e un bisturi, posiziona una pelle dorsale alla volta con il lato peloso rivolto verso il basso su una sottile capsula di Petri. Inizia a raschiare tutto il tessuto sottocutaneo, compreso il grasso dal lato ventrale del tessuto cutaneo, fino a quando non è semi-traslucido. Cerca di rimuovere il massimo tracce di tessuto sottocutaneo senza strappare la pelle (parte del follicolo pilifero). Inoltre, non raschiare a lungo ed evitare che la pelle si secchi.
   1. Conservare la pelle raschiata nella soluzione PBS fino a quando tutte le altre pelli rimanenti non vengono lavorate. Quindi, usando un bisturi, affettare le bucce in strisce di 0,5 cm x 1-1,5 cm e posizionare il lato peloso rivolto verso l'alto su una capsula di Petri sterile.
4. Pipettare con cautela 20 mL di soluzione di PBS/2x Gentamicina miscelata con tripsina (0,25%) in una piastra di Petri di plastica da 100 mm x 20 mm. Utilizzando una pinza sterile, trasferire le pelli e farle galleggiare con il pelo rivolto verso l'alto sulla superficie della soluzione di tripsina per 2 ore in un'incubatrice a 32 °C.
   NOTA: Il tempo e la temperatura di tripsinizzazione sono fondamentali per una buona resa di cheratinociti primari altamente coltivabili. Sebbene altri metodi possano fornire buone rese di cellule vitali, la coltivabilità dei cheratinociti è stata meno soddisfacente.
   1. Durante questo tempo di incubazione di 2 ore, rivestire le piastre con un rivestimento di collagene e posizionarle a 37 °C per 1 ora (vedere il passaggio 1.1.2). Per i saggi clonogenici, le piastre di Petri da 60 mm vengono rivestite 24 ore prima del prelievo dei cheratinociti per consentire allo strato di alimentazione 3T3 irradiato di attaccarsi al fondo e diffondersi uniformemente.
      nota: Il rivestimento delle piastre di coltura per la coltura clonogenica è molto importante per il corretto attaccamento, la formazione di colonie e la crescita/proliferazione finale dei cheratinociti epidermici dei topi.
5. Fase di raschiatura epidermica: Disporre una capsula di Petri quadrata di plastica sterile e creare una superficie inclinata di 30° per una corretta raschiatura epidermica con 15 ml di terreno di raccolta (vedi Tabella 1). Rimuovere con cautela una striscia di pelle galleggiante dalla soluzione di tripsina con una pinza curva. Quindi, con una nuova lama di bisturi, raschiare l'epidermide e i peli nel mezzo.
   1. Non usare una forza eccessiva, ma usare una forza sufficiente per raschiare l'epidermide o influire sulla vitalità cellulare.
   2. Durante la raschiatura dell'epidermide, mantenere la lama perpendicolare al pezzo di pelle. Se la lama è angolata verso il movimento della lama, ci sono più possibilità di lacerazione della pelle. Se la lama è angolata rispetto al movimento della lama, ci sono più possibilità di rimozione incompleta dell'epidermide.
6. Versare con cura il terreno di raccolta contenente le cellule epidermiche raschiate in un barattolo sterile da 60 ml (autoclavabile e riutilizzabile) con un'ancoretta magnetica da 1,5 pollici. Sciacquare la capsula di Petri con un ulteriore terreno di coltura per raccogliere le cellule epidermiche rimanenti e portare il volume finale a 30 ml. Utilizzare un agitatore magnetico e mescolare a 100 giri/min per 20 minuti a temperatura ambiente. Questo processo rimuoverà le cellule epidermiche intrappolate dai peli.
7. Posizionare un colino cellulare sterile da 70 μm sulla parte superiore di una provetta conica da 50 mL. Il filtro cellulare si inserisce sopra una provetta conica da 50 mL.
   1. Prendi il barattolo all'interno di una cappa di biosicurezza. Rimuovere l'ancoretta e versare il contenuto nel filtro del filtro collegato a una provetta conica da 50 mL. Filtrare i capelli indesiderati e i fogli di strato corneo.
   2. Premere i peli insieme ai materiali dello strato corneo all'interno del colino e manipolarli per rilasciare le cellule ciliate intrappolate. Utilizzare 5 mL di terreno di raccolta per consentire alle cellule intrappolate rimanenti di liberarsi e fluire nella provetta. Portare il volume totale fino a 50 ml in una provetta conica.
8. Tappare la provetta conica da 50 mL con filtrato cellulare e centrifugare a 160 x g per 7 minuti a 4 °C. Quindi, aspirare il surnatante e aggiungere 5 ml di terreno di raccolta. Infine, risospendere il pellet cellulare triturando delicatamente ~20x con una pipetta da 5 mL.
   1. A questo punto, conservare le celle in una ghiacciaia per evitare qualsiasi aggregazione. Quindi, aggiungere 25 ml di terreno di raccolta e triturare nuovamente (20-25x).
   2. Per garantire una conta accurata dei cheratinociti in questa fase, prelevare 1 mL di sospensione cellulare e aggiungere 19 mL di terreno di raccolta. Ora, la diluizione cellulare è 1:20 in una provetta conica da 50 mL. Se i cheratinociti vengono raccolti da un singolo topo, regolare il volume della sospensione cellulare. Ad esempio, invece di 30 mL, utilizzare 15 mL ed effettuare una diluizione 1:10 per contare le cellule.
9. Pipettare 0,5 mL di cellule diluite dalla provetta conica da 50 mL (diluizione 1:20) e trasferirle in una provetta per microcentrifuga autoclavata da 1,5 mL. Rimuovere 0,2 mL (200 μL) di miscela cellulare in un'altra provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere un volume uguale (200 μL) di soluzione di blu di tripano allo 0,4%. Mescolare delicatamente questa soluzione 3 volte e trasferire le cellule in un emocitometro per contare i cheratinociti nucleati.
   1. Assegna un punteggio a tutte le cellule blu scuro positivo per il blu di tripano come cellule morte non vitali e assegna un punteggio alle piccole cellule dorate e rosate come cellule vitali. Pertanto, la resa finale di cheratinociti per topo dovrebbe essere di circa 30 milioni di cellule vitali.
10. Centrifugare la provetta conica originale da 50 mL (dal punto 1.8) per 7 minuti a 160 x g a 4 °C. A questo punto, risospendere le cellule nel terreno desiderato ed effettuare la diluizione richiesta per la semina delle cellule.
    1. Per la coltura di massa, seminare da 2 a 4 milioni di cellule d'oro vitali in ciascuna piastra di Petri da 35 mm in terreno di coltura cellulare (terreno di tipo KGM + supplementi per colture monostrato) (vedere Tabella 1). Per un saggio clonogenico (formazione di colonie), seminare 1.000 cellule per piastra di Petri da 60 mm su strati di alimentazione 3T3 di topo svizzero irradiati con raggi X con rivestimento di collagene e terreno E di Willia modificato con integratori e siero.
    2. Utilizzare un totale di terreno da 2 a 4 ml per piastre di Petri da 35 mm e 60 mm, rispettivamente. Inoltre, formulare DMEM e Williams E medium acquistati da ATCC con livelli ridotti di bicarbonato di sodio per l'uso al 5% di CO₂.
11. Far crescere le cellule di coltura (di massa o clonogeniche) a 32 °C, 95% di umidità con 5% di CO₂. Cambia il supporto un giorno dopo il seeding iniziale per la coltura di massa, e poi 3 volte alla settimana in seguito. Tuttavia, per i saggi clonali, il primo cambiamento del terreno è 2 giorni dopo la semina cellulare e successivamente 3 volte alla settimana.
12. Per la coltura clonale, coltivare le cellule a intervalli di due e quattro settimane. Dopo il completamento delle colture clonali (2 o 4 settimane), aspirare il terreno. Fissare le colonie in formalina tamponata al 10% per una notte a temperatura ambiente e colorare con rodamina B allo 0,5% in acqua autoclave per 1 ora. Quindi, rimuovere la macchia di rodamina B con una pipetta dal bordo dei piatti.
    1. Sciacquare le stoviglie in acqua fredda autoclavata fino a quando le stoviglie non diventano chiare. Mettete i piatti inclinati sul coperchio dei piatti e lasciateli asciugare per il conteggio finale delle colonie. In particolare, quando si esegue il saggio di coltura clonogenica, non pipettare mai <1 mL di cellule. Se le cellule sono concentrate, diluire in serie la concentrazione cellulare.

Tabella 1: Soluzioni e ricette multimediali.