Transgenesi vettoriale miniCoopR: una tecnica per lo screening dei geni che inducono il melanoma nel modello tumorale di zebrafish

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Screening per i modificatori di insorgenza del melanoma

1. Creare cloni di ingresso centrale Gateway mediante PCR, amplificando l'intero frame di lettura aperto dei geni di interesse (GOI) e ricombinandosi in pDONR 221 utilizzando BP clonasi II (Invitrogen). Utilizzare la tecnologia Multisite Gateway (Invitrogen) per ricombinare p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA e miniCoopR per posizionare i geni di interesse sotto il promotore mitfa nel vettore miniCoopR (Figura 1A).
2. Iniettare 25 picogrammi di ciascun clone insieme a 25 picogrammi di mRNA della trasposasi Tol2 in una cellula Tg(mitfa:BRAFV600E); p53 (lf); embrioni di zebrafish triplo omozigoti come descritto in precedenza. Incubare gli embrioni iniettati a 28,5 °C. Rimuovere gli embrioni morti a 24 hpf.
3. Selezionare animali transgenici con melanociti salvati a 72 hpf posizionando la piastra di Petri contenente embrioni iniettati su un microscopio da dissezione sotto luce incidente su uno sfondo bianco (Figura 1A).
4. Trasferimento degli animali in vasche da 3 L nella nursery della struttura per il pesce zebra a 4 dpf.
5. A 2 mesi, selezionare gli animali con almeno un'area di salvataggio dei melanociti superiore a 4^mm2 (Figura 1A). Esiste una forte correlazione tra il grado di salvataggio dei melanociti a 72 hpf e il grado di salvataggio dei melanociti a 2 mesi. Quando gli embrioni con salvataggio dei melanociti vengono raccolti a 72 hpf, la maggior parte di essi (~80%) avrà almeno un'area di salvataggio dei melanociti superiore a 4 mm² a 2 mesi.
6. Screening settimanale degli animali selezionati per la presenza di tumori (Figura 1B). Esiste una forte correlazione tra cambiamenti istopatologici e morfologici. La transizione da benigna a maligna è riconosciuta come un cambiamento morfologico quando le lesioni vengono sollevate dalla superficie dell'animale. Isolare gli animali portatori di tumore per lo studio.
7. Disegna le curve di sopravvivenza libera da melanoma con l'età in settimane sull'ascissa e la percentuale di sopravvivenza libera da melanoma sull'ordinata. Gli animali con melanociti che esprimono un gene di interesse sono confrontati con gli animali di controllo che esprimono EGFP (proteina fluorescente verde potenziata) nei melanociti (Figura 1C). L'insorgenza mediana del tumore per gli animali a cui è stato iniettato miniCoopR-EGFP è di circa 18 settimane. Determinare se le due curve sono statisticamente diverse utilizzando un test di rango logaritmico.

Figura 1. Screening per i modificatori di insorgenza del melanoma utilizzando il test miniCoopR. A) Schema del saggio miniCoopR. Embrione con melanociti salvati (punta di freccia) contenente il vettore miniCoopR e il gene di interesse. Barra della scala = 250 μM. Adulto con recupero di melanociti superiore a4 mm 2 (punta di freccia). Barra della scala = 500 μM B) MiniCoopR-EGFP ha salvato il pesce zebra con un tumore amelanotico e uno pigmentato (punte di freccia). C) Curva rappresentativa di sopravvivenza libera da melanoma che confronta tumori che esprimono l'oncogene SETDB1 e un gene EGFP di controllo (p = 9,4×10-7, log-rank χ2).