Saggio di trapianto sottocutaneo: un metodo per trapiantare cellule di melanoma da un donatore a un modello di pesce zebra ricevente

Abstract

Fonte: Iyengar, S. et al. Screening per modificatori di melanoma utilizzando un modello di tumore autoctono di pesce zebra. J. Vis. Exp. (2012)

Questo video descrive il metodo per il trapianto di cellule tumorali dal modello di pesce zebra donatore portatore di melanoma a un ricevente immunocompromesso Casper zebrafish. Aiuta a visualizzare l'attecchimento e la proliferazione tumorale nel pesce ricevente.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Test di trapianto

1. Preparare il pesce Casper ricevente di 2-3 mesi irradiandolo con 25 Gy di irradiazione gamma un giorno prima del trapianto. Lascia che il pesce si riprenda nell'acqua del pesce.
2. Eutanasia di un pesce portatore di tumore secondo le linee guida istituzionali. In particolare, un pesce viene posto in un piatto con 0,6 mg/mL di tricaina fino a quando il movimento delle branchie non si ferma.
3. Tagliare il tumore e metterlo in una capsula di Petri con circa 5 mL di filtro sterilizzato 0,9x PBS con il 5% di FBS. Taglia il tumore con un rasoio mentre è in soluzione.
4. Lavorando a temperatura ambiente, triturare con una pipetta P1000 per ottenere singole cellule. Portare il volume a 25 mL con filtro sterilizzato 0,9x PBS con il 5% di FBS.
5. Filtrare attraverso un filtro a rete da 40 μM.
6. Centrifugare in una centrifuga da tavolo Eppendorf 5810R a 1.500 giri/min (453 giri/min) per 10 minuti.
7. Rimuovere il surnatante e portare la sospensione cellulare alla concentrazione approssimativamente desiderata (assumere 10-7 cellule per un tumore di 100 mm³).
8. Calcolare il numero esatto di cellule utilizzando un emocitometro e diluire la sospensione cellulare in modo che il volume finale di iniezione sia di circa 5 μl. Ad esempio, se devono essere iniettate 50.000 cellule, la sospensione cellulare deve essere diluita fino a una concentrazione finale di 10.000 cellule/μL. Agitare il tubo contenente la sospensione cellulare ogni pochi minuti per evitare la formazione di grumi sulle cellule.
9. Lavare una siringa Hamilton da 701 N 10 μL calibro 26s (punta smussata) 2-3 volte con etanolo al 100% e 0,9x PBS. Caricare la siringa con 5 μl di sospensione cellulare.
10. Anestetizzare il pesce ricevente irradiato con 0,17 mg/mL di tricaina. Posizionare il pesce su un lato su un Kimwipe umido (Figura 1A).
11. Stabilizzare il pesce con una mano e inserire l'ago con lo smusso rivolto verso l'alto con un angolo di 45° nel fianco del pesce sopra la cavità peritoneale circa a metà strada tra il limite posteriore del rombencefalo e il bordo anteriore della pinna dorsale. Premere delicatamente lo stantuffo (Figura 1B).
12. Lasciare che i pesci si riprendano in acqua fresca e osservare quotidianamente i pesci per l'attecchimento del tumore (Figura 1C). Se si è verificato un attecchimento, si può osservare anche una crescita continua e lo sviluppo della malattia.

Risultati

Figura 1. Trapianto di cellule di melanoma. A) Pesce zebra Casper non iniettato. Barra della scala = 500 μM. B) Sito di trapianto sottocutaneo (punta di freccia) su un ricevente Casper irradiato subito dopo l'iniezione con 50.000 cellule di melanoma. Barra della scala = 200 μM. C) Ricevente Casper irradiato...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti di ricombinazione gateway	Invitrogen
miniCoopR
casper Zebrafish
701N Siringa da 10 μl	Hamilton/Fisher	14-824
Filtro da 40 μM	BD Falco/Pescatore	Codice 352340
FBS	Invitrogen	26140079